滇重楼内生真菌的分离及其抗菌活性分析
施 蕊1，夏 菁1，王 娟2，叶 敏3，赵一鹤1，李 彪3，4＊
【摘 要】［摘 要］为了解滇重楼内生菌的多样性及其抗菌能力，采用切块法分离内生菌，采用形态学观察法初步鉴定内生真菌，采用对峙试验法分析内生菌的抗菌活性。结果表明：从滇重楼植物中分离到98株内生真菌，经微生物学形态观察，初步鉴定归属于4个目，6个科和12个属。分别是根霉属（Rhizopus）、镰孢菌属（Fusarium）、丝核菌属（Rhizoctonia）、束丝菌属（Ozonium）、组丝核菌属（Sclerotium）、青霉属（Penicillium）、头孢霉属（Cephalosporium）、梳霉属（Kickxella）、筒孢霉属（Cylindrium）、刚毛孢属（Pleiochaete）、小单头孢霉属（Acremoniella）及孔球孢属（Gilmaniella）。对植物土传病原菌立枯丝核菌、尖孢镰刀菌和烟草黑胫病菌有抑菌效果的共有8株，其中PPC－78和PPC－43对供试病原菌的抑菌效果最强，PPC－43对立枯丝核菌、尖孢镰刀菌和烟草黑胫病菌菌丝生长的抑菌率分别为88.76%、93.67%和82.31%，而PPC－78的抑制率分别是93.55%、100.00%和95.88%。 【期刊名称】贵州农业科学 【年(卷),期】2016(044)007 【总页数】3
【关键词】［关键词］滇重楼；内生真菌；抑菌活性
内生真菌是指生活在植物组织内部而不引起植物组织明显症状的真菌［1－2］。植物内生菌作为植物微生态系统中天然组成成分，能促进寄主植物适应环境，加强系统生态平衡。内生真菌能分泌毒素或抗生物质；内生真菌在分类单位上
与病原菌接近，可作为生物防治中有潜力的生物农药开发［3］。植物内生菌一方面能维持植物微生态系统的稳态；另一方面能占据植物组织内微生态位，抵御外来菌的入侵。
滇重楼〔Paris polyphylla Smith var.yunnansensis（Franch.）Hand〕分布于云南、贵州和四川，生长在海拔1 400～3 100m的常绿阔叶林、云南松林、竹林、灌丛或草坡，根茎入药，有清热解毒、消肿止痛及凉肝定惊之功效，用于疔肿痈肿、咽喉肿痛、毒蛇咬伤、跌打伤痛及惊风抽搐等症［4］。滇重楼在我国有悠久的药用历史，随着新药的研究开发，重楼成为著名中成药云南白药、宫血宁胶囊、季德胜蛇药片和抗病毒颗粒等产品的主要原料，制药工业的需求量逐年递增［5－6］。由于滇重楼种子有二次休眠现象［7］，种苗繁育存在巨大困难。因此，目前滇重楼的繁殖方法主要是根茎切块繁殖和组织培养等，但在育苗过程中创口和组培苗易受到病原菌侵染，导致重楼根腐病大面积发生，造成严重的经济损失。为解决这一问题，笔者通过分离维持滇重楼微生态稳定的内生真菌，并筛选具有抗真菌活性的菌株，以期筛选能够抵御外来病菌的内生菌，为滇重楼的幼苗繁育提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 滇重楼块茎 滇重楼块茎于2014年采自于云南省普洱市镇沅县中草药种植基地百草园。
1.1.2 培养基 试验培养基为PDA培养基。
1.1.3 供试病原菌 供试病原菌由云南农业大学农业生物多样性与病虫害控制教育部重点实验室提供，供病原菌株编号及其病原菌名称见表1，采用的病原菌
均为植物土传病害病菌。 1.2 滇重楼内生菌分离及鉴定
取健康重楼植株的根状茎，弃泥土，用水冲洗干净，晾干水分，按照以下步骤进行表面杀菌处理：0.2%升汞消毒10～30s，无菌水冲洗，75%酒精消毒10～60s，无菌水冲洗。在无菌条件下将重楼样品切成2cm×2cm的小块，种植于PDA培养基内，培养5～10d，观察培养基中有菌落形成后挑取菌落转接入PDA斜面培养基中，按常规微生物学方法分离、纯化和保藏。分离得到的菌株分别用PPC－01、PPC－02、PPC－03……按顺序编号。
采用真菌学插片培养方法，对分离获得的内生真菌进行显微形态观察，进行分类鉴定［8－9］。 1.3 抑菌性测定
滇重楼内生真菌的抑菌活性测定采用平皿对峙培养法，各供试病原菌和滇重楼内生真菌置28℃黑暗条件下培养3d后，用打孔器（直径6mm）沿其菌落边缘打菌饼，将内生真菌与病原菌菌饼接种于PDA平板上距中心15mm处同一直线上的两点中，同时以只接病原菌和内生真菌的平板作为对照，每处理重复3次，分别置于28℃恒温培养箱中黑暗培养。每24h观察1次，并分别测量病原菌菌落指向内生真菌菌落的半径和内生真菌菌落指向病原菌菌落的半径。 1.4 抑菌率计算方法
滇重楼内生真菌对病原菌的抑菌率公式：
抑菌率＝（对照病原菌菌落半径－病原菌菌落指向内生真菌菌落的半径）／对照病原菌菌落半径× 100% 1.5 数据统计
滇重楼内生真菌的分离及其抗菌活性分析
