5.2.2.2.3 结果判定
四株菌在有组氨酸培养基平皿表面各长出一条菌膜，在无组氨酸培养基平皿上除自发回 变菌落外无菌膜，说明受试菌株确为组氨酸缺陷型。
5.2.2.3 5.2.2.3.1
脂多糖屏障缺陷（ rfa ）的鉴定 接种
取菌液0.1 mL移入平皿，迅速将营养肉汤琼脂培养基
（冷
加热融化营养肉汤琼脂培养基。
却至50C左右）适量倒入平皿，混匀，平放凝固。将无菌滤纸片一片放入已凝固的培养基平 皿中央，用移液器在滤纸片上滴加 一个平皿。
0.1 %结晶紫溶液10卩L,37 C培养24小时，每个菌株做
5.2.2.3.2 结果判定
阳性者在纸片周围出现一个透明的抑制带，说明存在 rfa 突变。这种变化允许某些大分 子物质进入细菌体内并抑制其生长。 TA97、TA98、TA100和TA102均有抑制带，野生型鼠伤寒 沙门氏菌没有抑制带。
5.2.2.4 R 因子（抗氨苄青霉素）的鉴定 5.2.2.4.1
接种
加热融化营养肉汤琼脂培养基，冷却到
50C左右，适量倒入平皿中，平放凝固，用移液
R 因子
器吸0.8 %的氨苄青霉素10卩L,在凝固的培养基表面沿中线涂成一条带，待氨苄青霉素溶液 干后，用接种环取各菌株菌液与氨苄青霉素带相交叉划线接种，并且接种一个不具有 的菌株作氨苄青霉素抗性的对照，
37 C培养24小时，一个平皿可同时鉴定几个菌株。
5.2.2.4.2 结果判定
4 个菌株经过 24 小时培养，在氨苄青霉素带的周围依然生长不受抑制，即有抗氨苄青霉 素效应，证明它
们都带有 R 因子。
5.2.2.5 四环素抗性的鉴定
5.2.2.5.1 接种
用移液器各吸取 5卩L70 ^L0.8 %的四环素溶液和 0.8 %的氨苄青霉素溶液，在营养肉 汤琼脂培养基平皿表面沿中线涂成一条带，待四环素和氨苄青霉素溶液干后，用接种环取各 菌株菌液与四环素和氨苄青霉素带相交叉划线接种
抗性的对照），37 C培养24小时。
TA102和一种有R因子的菌株（作四环素
5.2.2.5.2 结果判定
表明TA102菌株有抗四环素效应。
TA102菌株生长不受抑制，对照菌株有一段生长抑制区， 5.2.2.6 uvrB 修复缺陷型的鉴定 5.2.2.6.1
接种
在营养肉汤琼脂培养基平皿表面用接种环划线接种需要的菌株。接种后的平皿一半用墨 纸覆盖，在距15
W紫外线灭菌灯33 cm处照射8秒，37 C培养24小时。 5.2.2.6.2
结果判定
对紫外线敏感的三个菌株（TA97、TA98、TA100）仅在没有照射过的一半生长，具有野生 型切除修复酶的菌株 TA102仍能生长。
5.2.2.7 5.2.2.7.1
生物素缺陷型（ bio ）的鉴定 底层培养皿的制备
加热融化底层培养基两瓶。一瓶加生物素，每 100 mL底层培养基中加 0.5 mmol分子D-
生物素0.6 mL和L-组氨酸1 mL;另一瓶不加生物素，每 100 mL底层培养基中加 L-组氨酸1 mL,冷却至50
C左右，每种底层培养基各倒两个平皿。
5.2.2.7.2 接种
取有生物素和无生物素培养基平皿各一个，按菌株号顺序各取一接种环的菌液划直线于 只供学习与交流
5.2.2.7.3 结果判定
四株菌在有生物素培养基平皿表面各长出一条菌膜，在无生物素培养基平皿上除自发回 变菌落外无菌膜，说明受试菌株确为生物素缺陷型。
5.2.2.8 5.2.2.8.1
自发回变率的测定 测定方法
准备底层培养基平皿 8个。融化顶层培养基 8管，每管2mL,在45C水浴中保温。在每 管顶层培养基中，分别加入待鉴定的测试菌株的菌液
0.1mL, —式两份，轻轻摇匀，迅速将此
试管内容物倒入已固化的底层培养基平皿中，转动平皿，使顶层培养基均匀分布，平放固化， 37 C培养48小时，计数菌落数。
5.2.2.8.2 结果判定
每一株的自发回变率应落在附录 A A.3所列的正常范围内。
5.3 菌株的保存
鉴定合格的菌株应保存在深低温 （如-80 C）,或加入9%光谱级DMS（作为冷冻保护剂保存在 液氮条件下（-
196 C）。无上述条件者可冰冻干燥制成干粉， 6试验设计及受试物的处理 6.1
溶剂
溶剂要不与受试物发生反应，对所选菌株和 于不溶于水的受试物可选择其他溶剂，首选 其他溶剂。
4 C保存。除液氮条件外，保
存期一般不超过2年。主平板贮存在 4C,超过二个月后应丢弃（TA102除外，保存两周后丢 弃）。
S9没有毒性，没有诱变性。首选蒸馏水，对 DMSO每皿最高添加量不超过
0.1 mL ）。也可选择
6.2 剂量设计
决定受试物最高剂量的原则是受试物对试验菌株的毒性和受试物的溶解度。进行预试验有 助于了解受试物
对菌株的毒性和受试物的溶解度。对于无细菌毒性的可溶性受试物推荐的最 高剂量是5 mg/皿或5卩L/皿；对于溶解度差的受试物，可以采用悬浊液，但溶液浑浊的程 度（沉淀的多少）不能影响菌落计数。由于溶解度或者毒性的限制最大剂量达不到
5 mg/皿或
5卩L/皿时，最高剂量应为出现沉淀或细菌毒性的剂量。评价含有潜在致突变杂质的受试物 时，试验剂量可以
高于
5 mg/皿或5卩L/皿。对于需要前处理的受试物（如液体饮料、袋泡
，其剂量设计应以处理后的样片计。
茶、口服液和辅料含量较大的样品等） 每种受试物在允许的最高剂量下设 原则设定剂量间隔，推荐采用
一般受试物的最低剂量不低于
10
4个剂量组，包括加和不加 S9两种情况。按等比组距的
倍组距。每个剂量应作 3个平行皿。
0.2卩g/皿。
受试物应无菌，必要时以适当的方法灭菌或除菌。
6.3 对照组的设置
试验应同时设阳性对照组、溶剂对照组和未处理对照组，包括加和不加
S9种情况。
阳性对照物要根据所采用的菌株进行选择，并选择合适的剂量以保证每次试验的有效性， 可参考附录B、附录C或其他资料。
溶剂对照组的处理方法除不加入受试物外与处理组相同。
当阳性致突变物采用 DMSO溶解，而受试物不用 DMSO溶解时，应同时做 DMSO溶剂对照。
6.4 含组氨酸受试物
对已知和经证实含有组氨酸并可能影响试验结果的受试物必要时进行预处理（如经
XAD-n树脂柱过滤）。
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7试验方法 7.1总则
常用的实验方法有平板掺入法、预培养平板掺入法和点试法等。
7.2 721
平板掺入法
将主平板或冷冻保存的菌株培养物接种于营养肉汤培养基内，
37 C振荡（100 次/min ）
培养10小时或静置培养16小时，使活菌数不少于 1?2 109/mL。
7.2.2 7.2.3 7.2.4
底层培养基平皿，每个剂量加 S9和不加S9均做3个平皿。
，每管2mL在45C
融化顶层培养基分装于无菌带帽小试管（试管数与平皿数相同）
水浴中保温。
在保温的顶层培养基（试管）中依次加入测试菌株新鲜增菌液
0.1mL，混匀；实验组
加受试物0.05 mL?0.2mL （一般加入0.1mL，需活化时另力口 10% S9混合液0.5mL）,再混匀， 迅速倾入铺好底层培养基的平皿上，转动平皿使顶层培养基均匀分布在底层培养基上，平放 固化；37C培养48小时观察结果，必要时延长至
72小时观察结果。
7.2.5 阳性对照组加入同体积标准诱变剂；溶剂对照组只加入同体积的溶剂；未处理对照组 只在培养基上加
菌液；其他方法同上。
7.3 预培养平板掺入法
预培养对于某些受试物可取得较好效果。因此可根据情况确定是否进行预培养。在加入 顶层培养基前，
先进行以下预培养步骤：
a） 将受试物（需活化时另加
或在30 C中培养 30 min ；
10% S9混合液0.5 mL ）和菌液，在37 C中培养20 min ,
b） 再加入2 mL顶层琼脂.
其他同上述平板掺入法。
7.4 7.4.1 7.4.2 7.4.3 7.4.4
点试法 同 7.2.1 同 7.2.2 同 7.2.3
在水浴保温的顶层培养基中依次加入测试增菌液 0.1 mL （需活化时另加10% S9混合
液0.5 mL）,混匀，迅速倾入底层培养基上，转动平皿，使顶层培养基在底层分布均匀。平放 固化后取无菌滤纸片（直径约为
6 mm,小心放在已固化的顶层培养基的适当位置上，用移液
器取适量受试物（如 10卩L）,点在纸片上，或将少量固体受试物结晶加到纸片或琼脂表面； 37 C培养48小时观察结果。
7.4.5 另作阳性对照组和溶剂对照组，分别在滤纸片上加入同体积标准诱变剂、溶剂，未处 理对照组滤纸片
上不加物质，其他步骤同上。
8数据处理与结果评价 8.1 8.2
背景菌苔观察和回变菌落计数
直接计数培养基上的回变菌落数，计算各菌株各剂量三个平皿回变菌落数的均数和标准 差。 掺入法结果评价
在背景生长良好的条件下，测试菌株 于或大于溶剂对照组的
TA1535 TA1537、TA98和大肠杆菌的回变菌落数等
3倍，其它测试菌株的回变菌落数等于或大于阴性（溶剂）对照组的 资料收集于网
络，如有侵权 请联系网站删除 倍，并具有以下两种情况之一的可判定为阳性结果：
a） 有剂量反应关系；
食品科学毒理学实验教案()
