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4.2.2 营养肉汤琼脂培养基
琼脂粉 1.5g ，
加营养肉汤培养基至 100mL，
加热融化后调节 pH为7.4 , 0.103 MPa 20min 灭菌。
4.2.3 底层培 养基
在400mL灭菌的1.5 %琼脂培养基（100 C）中依次加入磷酸盐贮备液 8mL, 40 %葡萄糖 溶液20mL,充分混匀，待凉至 80 C左右时用于倒平皿。每平皿按 25mL （相对于90mm平皿） 制备平板，冷凝固化后倒置于 37 C培养箱中24小时，备用。磷酸盐贮备液、 40%葡萄糖溶 液和 1.5 %琼脂培养基配方如下：
4.2.3.1
磷酸盐贮备液（Vogel-Bonner minimal medium E, 50 x ）
磷酸氢钠铵（ NaNH4HPO4?4H2O） 17.5g， 柠檬酸（ C6H8O7?H2O） 磷酸氢二钾（ K2HPO4）
10.0g 50.0g
， ， ，
硫酸镁（ MgSO4?7H2O） 1.0g
加蒸馏水至100mL溶解（注：待其他试剂完全溶解后再将硫酸镁缓慢放入其中继续溶解， 否则容易析出沉淀） ， 0.103 Mpa 20min 灭菌。
4.2.3.2 40% 葡萄糖溶液
葡萄糖 40.0g 加蒸馏水至 100mL， 0.055 MPa 20min 灭菌。
4.2.3.3 1.5 %琼脂培养基
称琼脂粉6.0g加入400 mL三角瓶，加蒸馏水至 400 mL,融化后，0.103 MPa20min灭菌。
4.2.4 顶层培养基
加热融化顶层琼脂，每 100 mL顶层琼脂中加10mL 0.5 mmol/L组氨酸—生物素溶液。混
2mL 45C水浴
匀，分装在4个烧瓶中，0.103 MPa 20min灭菌。用时融化分装小试管，每管 中保温。顶层琼脂和 0.5 mmol/L 组氨酸—生物素溶液配制如下。
4.2.4.1 顶层琼脂
称琼脂粉 3.0 g ，氯化钠 2.5 g 加蒸馏水至 500 mL， 0.103 MPa 20min 灭菌。
4.2.4.2 0.5 mmol/L 组氨酸—生物素溶液（诱变试验用）
称D-生物素（分子量244） 30.5 mg和L-组氨酸（分子量155） 19.4 mg加蒸馏水至250 mL 0.103
MPa 20min 灭菌。 4.2.5
特殊试剂及培养基
4.2.5.1 0.8 %氨苄青霉素溶液（鉴定菌株用，无菌配制）
氨苄青霉素40 mg用0.02 mol/L
氢氧化钠溶液稀释至 5 mL,保存于冰箱。
4.2.5.2 0.1 %结晶紫溶液（鉴定菌株用）
100 mg 结晶紫,溶于无菌水至 100 mL。
4.2.5.3 L- 组氨酸溶液和 0.5 mmol/L D- 生物素溶液（鉴定菌株用）
L-组氨酸0.4043 g和D-生物素12.2mg分别溶于蒸馏水至 100mL, 0.103 Mpa 20min灭菌， 保存于4
C冰箱。
4.2.5.4 0.8 %四环素溶液（用于四环素抗性试验和氨苄青霉素 -四环素平板）
40 mg四环素用0.02 mol/L 4.2.5.5
氨苄青霉素平板（用作
盐酸缓冲液稀释至 5 mL,保存于4C冰箱。
TA97、TA98 TA100菌株的主平板）和氨苄青霉素—四环素
平板（用作TA102菌株的主平板）每1000 mL中由以下成分组成
底层培 养基 980 mL ，
组氨酸水溶液（ 0.4043g/100mL ） 10 mL，
0.5 mmol/L 生物素 6 mL ，
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0.8 ％氨苄青霉素溶液 3.15 mL ， 0.8 ％四环素溶液 0.25 mL ，
四环素仅在使用对四环素有抗性的
TA102 时加入。以上成分均已分别灭菌或无菌制备。
4.2.5.6 组氨酸－生物素平板（组氨酸需要试验用）
每 1000mL 中由以下成分组成： 底层培 养基 984mL ，
组氨酸水溶液（ 0.4043/100mL ） 10mL，
0.5mmol/L 生物素 6mL， 以上成分均已分别灭菌。 425.7
二甲亚砜（DMSO：光谱纯，无菌。
4.2.6 阳性诱变剂的配制 根据所选择的诱变剂的种类和剂量用适当的溶剂配制阳性对照品（见附录 B、 C）。 4.3 10% S9 混合液的制备
10% S9混合液由S9组分和S9辅助因子以适当比例组成，用作试验中的活化系统。 4.3.1 S9 辅助因子的配制 4.3.1.1 镁钾溶液
氯化镁 1.9 g 和氯化钾 6.15 g 加蒸馏水溶解至 100 mL。
4.3.1.2 0.2 mol/ L 磷酸盐缓冲液（ pH 7.4）
磷酸氢二钠（ Na2HPO4, 28.4g/L ）440 mL， 磷酸二氢钠（ NaH2PO4?H2O, 27.6g/L ）60 mL， 调pH至7.4， 0.103 MPa 20min 灭菌或滤菌。
4.3.1.3
辅酶-H （氧化型）溶液
无菌条件下称取辅酶-H,用无菌蒸馏水溶解配制成
0.025 mol/L 溶液，现用现配。
4.3.1.4 4.3.2
葡萄糖 -6- 磷酸钠盐溶液
无菌条件下称取葡萄糖 -6- 磷酸钠盐，用无菌蒸馏水溶解配制成 0.05 mol/L ，现用现配。
大鼠肝S9组分的诱导和配制
选健康雄性成年 SD或Wistar大鼠，体重150?200 g左右，周龄约 5?6周。将多氯联苯 （Aroclor1254 ）溶于玉米油中，浓度为 天后处死动物，处死前禁食 12h。
也可采用苯巴比妥钠和 3-萘黄酮联合诱导的方法进行制备，经口灌胃给予大鼠苯巴比妥 钠和3 -萘黄酮，剂量均为 80mg/kg，连续3天，禁食16h后断头处死动物。其他操作同多氯 联苯诱导。
处死动物后取出肝脏，称重后用新鲜冰冷的 0.15 mol/L 氯化钾溶液连续冲洗肝脏数次， 以便除去能抑制微粒体酶活性的血红蛋白。每克肝（湿重）加
200g/L，按500 mg/kg BW无菌操作一次腹腔注射， 5
0.1 mol/L 氯化钾溶液 3 mL，
连同烧杯移入冰浴中， 用消毒剪刀剪碎肝脏， 在玻璃匀浆器 （低于 4000 r/min ，往复 1?2 min） 或组织匀浆器（低于 20000 r/min ， 1 min ）中制成肝匀浆。以上操作需注意无菌和局部冷环 境。
将制成的肝匀浆在低温（0 C?4 C）高速离心机上以 9000 g离心10 min，吸出上清液 为S9组分，分装于无菌冷冻管或安瓿中， 每安瓿2 mL左右，最好用液氮或干冰速冻后置 -80 C 低温保存。
S9组分制成后，经无菌检查，测定蛋白含量（ Lowry法），每毫升蛋白含量不超过 40mg为
宜，并经间接致癌物（诱变剂）鉴定其生物活性合格后贮存于深低温或冰冻干燥，保存期不 超过一年。
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433 10% S9 混合液的制备
一般由S9组分和辅助因子按 1 : 9组成10%勺S9混合液，也可将浓度配制成 30 % （不同 受试物所需
S9浓度不同），临用时新鲜无菌配制，或过滤除菌。
下：
取上述：磷酸盐缓冲液
镁钾溶液
10% S9混合液10mL配制如
6.0 mL , 0.4 mL 1.6 mL 1.0 mL
葡萄糖-6-磷酸钠盐溶液1.0 mL , 辅酶-n溶液 肝S9组分
混匀，置冰浴中待用。
用每皿0.5 mL S9混合液（含20讥?50 ^LS9 ）测定其对已知阳性致癌物（诱变剂）的 生物活性，确定最适用量，或者按一般用量，即每平皿
, ,
0.5 mL S9混合液。
5菌株及其鉴定与保存 5.1 5.1.1
试验菌株 推荐菌株组合1
推荐采用下列的菌株组合:
a） 鼠伤寒沙门氏菌 TA1535;
b） 鼠伤寒沙门氏菌 TA97a 或 TA97 或 TA1537; c） 鼠伤寒沙门氏菌 TA98;
d） 鼠伤寒沙门氏菌 TA100;
e） 鼠伤寒沙门氏菌 TA102或大肠杆菌 WP2uvrA或大肠杆菌 WP2uvrA(PKM101。 5.1.2 推荐菌株组合2
可采用四株鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株
TA97、TA98、TA100和TA102。
5.2 5.2.1
菌株的鉴定 总则
菌株特性应与回复突变试验标准相符。菌株的鉴定包括：基因型鉴定、自发回变数鉴定和 对阳性致突变物敏感性的鉴定。
每3个月进行一次菌株鉴定，遇到下列情况也应进行菌株鉴定：
a） 在收到培养菌株后；
b） 当制备一套新的冷冻保存或冰冻干燥菌株时； c） 重新挑选菌株时； d） 使用主平板传代时； 5.2.2 5.2.2.1
鉴定方法 增菌培养
在5 mL营养肉汤培养基中用接种环接种贮存菌培养物，
9
37 C振荡（100次/min ）培养
10小时或静置培养 16小时，使活菌数不少于 5.2.2.2 5.2.2.2.1
组氨酸缺陷型（his ）的鉴定 底层培养皿的制备
1?2 10/mL。
加热融化底层培养基两瓶。一瓶不加组氨酸，每 100 mL底层培养基中加 0.5 mmol分子
D-生物素0.6 mL ;另一瓶加组氨酸，每 100mL底层培养基中加 L-组氨酸1 mL和0.5 mmol分 子D-生物素0.6mL。冷却至50C左右，每种底层培养基各倒两个平皿。
5.2.2.2.2 接种
取有组氨酸和无组氨酸培养基平皿各一个，按菌株号顺序各取一接种环的菌液划直线于
食品科学毒理学实验教案()
