牛奶中酪蛋白和乳糖的分离及鉴定
谢青翠 吴艳贞 马冬妮
（大理学院药学与化学学院 大理 671000）
摘要：本文通过用等电沉淀法从牛奶中分离酪蛋白和乳糖，并且采用颜色反应和旋光性鉴定酪蛋白和乳糖。
关键词：牛奶；酪蛋白；乳糖；分离；鉴定
Isolation and identification of casein and lactose in milk
XIE Qing-cui, WU Yan-zhen, MA Dong-ni
(College of pharmacy and Chemistry ,Dali University．Dali 671000，Yunnans，China)
Abstract: This paper isolated by isoelectric precipitation of casein and lactose from milk,
and the use of color reactions and optically active identification of casein and lactose.
Keywords: Milk; Casein protein; Lactose; Isolation; Identification
牛奶是一种乳状液主要由水、脂肪、蛋白质、乳糖和盐组成。酪蛋白是牛奶中的主要蛋白质,是含磷蛋白质的复杂混合物。蛋白质是两性化合物,当调节牛奶的pH达到酪蛋白的等电点(pH=4.8)时蛋白质所带正、负电荷相等,呈电中性,此时酪蛋白的溶解度最小,会从牛奶中沉淀出来,以此分离酪蛋白。因酪蛋白不溶于乙醇和乙醚,可用此两种溶剂除去酪蛋白中的脂肪。
乳糖是一种二糖,它由D-半乳糖分子C’上的半缩醛羟基和D-葡萄糖分子C4上的醇羟基脱水通过B-1,4苷键连接而成。乳糖是还原性糖,绝大部分以α-乳糖和β-乳糖两种同分异构体型态存在, 20゜C时α-乳糖的比旋光度为+86゜,β-乳糖的比旋光度为+35゜,水溶液中两种乳糖可互相转变,因此其水溶液有变旋光现象。乳糖也不溶于乙醇,当乙醇混入乳糖水溶液中,乳糖会结晶出来,从而达到分离的目的。
1材料、仪器与试剂
1.1材料
来思尔袋装纯牛奶
1.2仪器
DF—101S恒温水浴锅（巩义市予华仪器有限公司）、SHZ—D(Ш)循环水式真空泵（巩
义市予华仪器有限公司）、圆盘旋光仪、酸度计
1.3试剂
10%醋酸溶液、95%乙醇、乙醚、碳酸钙固体、1%CuSO4溶液、5%NaOH溶液、茚三酮溶液、浓硝酸溶液、浓氨水
2实验方法
2.1牛奶中酪蛋白的分离
取100mL新鲜牛奶,在恒温水浴中加热至40゜C,边搅拌边慢慢加入10%醋酸溶液,使牛奶pH=4.8,用尼龙布过滤酪蛋白并用蒸馏水洗涤一两次(在滤液中加入一定量的粉状碳酸钙并搅拌几分钟，留作下面的实验2.2使用。)把沉淀转移至烧杯中，依次用乙醇、乙醇和乙醚的等体积混合液、乙醚洗涤酪蛋白,去除脂肪,每次洗涤都用玻璃棒充分搅拌酪蛋白以很好的除去脂肪。抽滤后把固体转移至表面皿上，让乙醚挥发掉，称其重量得9.0g。
2.2牛奶中乳糖的分离
将2.1中加入碳酸钙的滤液进行加热，使其沸腾一段时间后，抽滤以除去蛋白质和多余的碳酸钙,把滤液转移至烧杯中浓缩至约15mL,稍冷后,在热溶液中加入约90mL95%乙醇,再加热,使其混合均匀,趁热过滤,滤液应澄清。滤液移至锥形瓶中,加塞,放置1-2天,让乳糖充分结晶,过滤分离出乳糖晶体。用冷的95%乙醇洗涤结晶,一般应对乳糖重结晶,干燥后称重得1.94g。
2.3牛奶中酪蛋白的鉴定
2.3.1双缩脲反应
在小试管中加入5滴酪蛋白溶液和5滴5%NaOH,摇匀后加入2滴1%硫酸铜溶液。
将试管振摇；观察颜色变化。
2.3.2茚三酮反应
在小试管中加入10滴酪蛋白溶液，然后加4滴茚三酮试剂，加热至沸腾，即有蓝紫色出现。
2.3.3蛋白黄色反应
在小试管中，加入10滴酪蛋白溶液及
3滴浓硝酸，水浴中加热，生成黄色硝基化合物。冷却后再加入15滴5%NaOH溶液，溶液呈橘黄色。
2.4牛奶中乳糖的旋光度测定
准确称取1．25g乳糖，用少量蒸馏水溶解，转入25 mL容量瓶中定容，将溶液装于旋光管中，立即测定其旋光度。每隔1min测定1次，至少测定6次，8min内完成，记录数据。10min后，每隔2min测定1次，至少测定8次，20min内完成。记录数据并计算出比旋光度。迅即在样品管中加入2滴浓氨水摇匀，静置20min后测其旋光度并计算出比旋光度。
3结果与讨论
3.1实验结果
从100ml牛奶中分离得到的酪蛋白的质量为9.0g,则牛奶中酪蛋白的含量为9.0g/100mL。
从100ml牛奶中分离得到的乳糖的质量为1.94g，则牛奶中乳糖的含量为1.94 g/100mL。
在酪蛋白的鉴定实验中，加入双缩脲试剂时溶液呈紫色；加入茚三酮时溶液呈紫色；加入浓硝酸加热后产生黄色沉淀，加入氢氧化钠后溶液呈橘黄色。
在牛奶中乳糖的旋光度测定实验中，乳糖溶液较浑浊未测出旋光度。
3.2讨论
分别加入双缩脲试剂、茚三酮时溶液、浓硝酸溶液进行酪蛋白鉴定时，实验所观察到的溶液颜色均与理论颜色相符合，说明从牛奶中分离出来的蛋白质确实是酪蛋白。
本实验未能测出乳糖的比旋光度的原因可能是乳糖未经过重新洗涤结晶导致乳糖溶液浑浊，不能测出旋光度。
分离出来的酪蛋白干燥后带有一点黄色与理论的白色相比不太符合，可能是脂肪为除净导致的。
本实验中所使用的碳酸钙，主要是用以中和过剩的醋酸，避免在后面的实验中乳糖在酸性条件下水解，从而影响收得率。
4.实验注意事项
酪蛋白等电点随温度不同而变化 , 等电点 pH 为 4. 6 ～ 4. 8 。分离酪蛋白 ,
边加醋酸 ,边搅拌 , 边测 pH, 同时观察沉淀。开始快搅拌 , 接近等电点时 , 应慢搅拌。
酪蛋白沉淀用 200 目的尼龙布过滤比较好 , 同时进行抽滤。用滤纸很难过滤 ; 而用纱布过滤 , 酪蛋白容易粘在其上。
用乙醇和乙醚清洗酪蛋白沉淀时 , 应将酪蛋白捣碎 , 并在溶剂中搅拌、 浸泡 , 充分洗净脂肪。纯净的酪蛋白应为白色 , 若发黄表明脂肪未洗干净。
首次结晶出来的乳糖含有杂质 , 一般需要重结晶 , 否则乳糖难以溶解 , 且溶
液混浊 , 测定的旋光度不准。
测定乳糖的平衡旋光度时 , 应放置数小时或加入 2 滴浓氨水 , 待平衡后再测。 抽滤过程所用乙醚是挥发性、有毒的有机溶剂，最好在通风橱内操作。
参考文献
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牛奶中酪蛋白和乳糖的分离及纯度鉴定论文伏孟瑜
