细胞冷冻保存方法实验方案
ECACC实验室手册（第4版） 默克带你走进细胞培养实验室。
目标
图 1.细胞系冻存
下述实验方案描述了细胞冷冻保存方法，包括采用-80°C冷冻电冰箱冷冻保存细胞系。ECACC 通常使用可编程速率可控冰柜。这是最可靠、最具可重现性的细胞冻存方法，但由于此类设备的成本超出了大多数研究实验室所能承受的范围，因此下文将详细描述其他一些方法。如果需要定期冷冻大量细胞培养物，则建议使用可编程速率可控冰柜。
材料
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冷冻培养基（通常为90% FBS、10% DMSO (C6164)或甘油(C6039)） 70％ (v/v) 乙醇无菌水溶液(793213) PBS，不含Ca2+ / Mg2+(D8537)
0.05% 胰蛋白酶 / EDTA，溶于HBSS中，不含Ca2+/Mg2+(T3924) ? DMSO (D2650)
设备
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个人防护装备（无菌手套、实验室工作服） 全脸保护面罩 / 护目镜 设置为37°C的水浴
适当密封水平的微生物安全柜 离心机 细胞计数板
预先贴好标签的安瓿瓶 / 冷冻管 细胞冷冻装置
要点
1. 最常用的细胞冷冻保护剂是二甲基亚砜（DMSO），然而，它并不适用于所有细胞系，
例如HL60，因为DMSO会诱导这种细胞分化。在这种情况下，应使用甘油等替代品（有关正确的细胞冷冻保护剂详情，请参阅ECACC数据表）。
2. 上面推荐的ECACC冷冻培养基已被证明是适合大多数细胞类型的良好的通用培养基。
另一种常用的细胞冷冻培养基配方是：70％基础培养基、20％ FBS、10％ DMSO，但可能不适用于所有细胞类型。在定期使用之前，请确认是否适用于自身细胞。 3. 至关重要的是，培养物必须是健康的，并处于生长的对数阶段。用预先汇合的培养物
（低于其最大细胞密度的培养物），在细胞冷冻之前24小时更换培养基，即可实现这种条件。
4. 冷却速率可以改变，但一般原则是，每分钟降低1℃至3℃经证适合于大多数细胞培养
物。
5. Mr. Frosty系统的替代方案是Taylor Wharton被动式冷冻柜，其中的安瓿瓶保存在杜瓦
瓶颈的液氮蒸气中。该系统可让安瓿瓶逐渐降低，温度随之而降低。目前也有降温速率可控的冷冻柜，定期冷冻大量安瓿瓶时特别有用。
6. 最后，如果没有任何其他设备可用，可以将安瓿瓶放置在隔热良好的盒子内（例如壁厚
至少1 cm的聚苯乙烯盒子），并置于-80℃下过夜。重要的是必须确保盒子在整个冷冻过程中保持直立。冷冻后的安瓿瓶应转移到液氮储存容器的气相中并记录位置。 7. 如果使用涉及-80°C冰柜的冷冻方法，则必须针对细胞系冷冻分区，避免无意取出样
品。如果在冷冻的关键阶段出现这一类误操作，细胞活力会受影响。
图 2.DMSO瓶
图 3.Mr. Frosty容器
操作流程
1. 使用倒置显微镜观察培养物，以评估细胞密集程度，并确认不存在细菌和真菌污染物。
收获在对数生长期细胞。对于贴壁细胞系，收获细胞汇合度应尽可能接近80-90％。 2. 用上述胰蛋白酶/EDTA使贴壁和半贴壁细胞悬浮，并将其重悬于至少相当于胰蛋白酶体
积的一定体积的新鲜培养基中。悬浮细胞系可直接使用。
3. 取出一小部分细胞（100-200μL）并进行细胞计数。理想情况下，为实现良好的冷冻复
苏率，细胞活率应超过90％。
4. 将剩余的培养物以150 x g离心5分钟。
5. 在冷冻培养基中以2-4x106个细胞/mL的浓度重悬细胞。
6. 将1 ml 细胞等分移液到贴有标签的冷冻安瓿瓶中，标签须注明细胞系名称、传代数、细
胞浓度和日期。
7. 将安瓿瓶放入被动式冷冻柜内。用异丙醇填充冷冻柜，并设置为-80℃过夜。 8. 冷冻后的安瓿瓶应转移到液氮储存容器的气相中并记录位置。
细胞冷冻保存方法实验方案
