By 医药观察媛
分子生物学常用实验技术操作方法
目录
一、感受态细菌制备 ......................................................................................... 2 二、质粒转化 ....................................................................................................... 2 三、质粒提取 ....................................................................................................... 2 四、质粒转染 ....................................................................................................... 3 五、siRNA转染 .................................................................................................. 3 六、免疫印迹分析WB ..................................................................................... 3 七、BCA蛋白定量 ............................................................................................ 4 八、细胞总mRNA提取 ................................................................................... 4 九、Real-time quantitative PCR 检测 mRNA 的表达 ............................. 5 十、免疫沉淀 ....................................................................................................... 5 十一、MTT法检测细胞增殖 .......................................................................... 6 十二、细胞克隆实验 ......................................................................................... 6
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一、感受态细菌制备
取冻存Top 10 菌液冰上解冻，无菌吸取50 μl至4 ml LB培养基中，放于摇床200 rpm，37 ℃培养过夜。次日无菌吸取约40 μl菌液重新接种到4 ml LB培养基中，继续孵育1 ~ 2 小时。将菌液分装转移至无菌2 ml离心管中，冰上放置10 ~ 15 分钟，4 ℃，3,000 × g 离心 5 分钟收集菌体。弃去上清，用 1 ml 预冷的 100 mM CaCl2轻轻重悬细菌，冰上放置 30 分钟，4 ℃，3,000 × g 离心 5 分钟收集细菌。弃去上清，加入 100 μl 预冷的 100 mM CaCl2轻重悬细菌，存于 4 ℃，在 12 ~ 24 小时内使用；或加入灭菌的甘油，使其终浓度为 15 %（v/v），保存于- 80 ℃。 二、质粒转化
取 10 μl 上述连接产物与50 μl感受态细菌混合，冰上放置30 分钟，后放入 42 ℃水浴中热激90秒，迅速取出放至冰上冷却 2 分钟，加入 500 μl LB 培养基，摇床 200 rpm，37 ℃培养 1 小时使细菌复苏。6,000 rpm 离心5分钟，弃去上清，用100 μl LB 培养基重悬细菌沉淀，用接种棒将菌液均匀涂抹在含有氨苄青霉素的固体培养基上，在超净台中晾干，放在37 ℃培养箱中过夜培养。第二天可挑取单菌落接种于4 ml LB 培养基中过夜培养，送样测序或加入终浓度为20 %的甘油冻存于- 80 ℃ 三、质粒提取
取- 80 ℃冻存的菌液 50 μl 或挑取培养皿中的单菌落接种于 4 ml 含有青霉素的LB培养基中培养8小时，接着扩增至 50 ml 过夜培养。使用无内毒素质粒中提试剂盒（CWBIO） 提取质粒：收集菌液，> 6,200 × g 离心 3 分钟， 吸尽上清。向菌体沉淀中加500 μl Buffer P1（提前加入 RNase A），悬浮沉淀；再加入 500 μl Buffer P2， 温和地上下颠倒混匀， 室温静置 5 分钟； 再加入 500 μl Buffer E3，立即上下颠倒混匀，出现白色絮状沉淀，静置5分钟。 16,200× g 离心10分钟，吸取上清加入过滤柱（Endo - Remover Column），16,200 × g离心1分钟过滤向滤液中加入 450 μl 异丙醇，上下颠倒混匀。 向收集管的吸附柱（Spin Column DL）中加入
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200 μl Buffer PS，16,200 × g 离心1分钟过滤进行柱平衡。 将上述的滤液转移至平衡好的吸附柱中，16,200 × g 离心 1 分钟，弃掉 废液；再向吸附柱加入 750 μl Buffer PW（提前加入无水乙醇），16,200 × g 离心1 分钟，弃掉废液； 再将吸附柱 16,200 × g 离心 2 分钟，弃掉废液，室温干燥 5分钟。向吸附膜的中间部位加入 50 ~ 100 μl ddH2O，室温静置5分钟，16,200 × g离心2分钟， - 20 ℃保存质粒。 四、质粒转染
转染前将待转染的细胞以 1 ~ 2 × 105每孔的密度种于 6 孔板中培养。24 小时后， 待细胞长至 50 ~ 80 % 时，按照
DNAfectinTM Plus（Abmart） 说明书进行转染：准备无菌的 1.5 ml 离心管， 先加入 2 μg 的质粒， 再加入 200 μl OPTI-MEM培养基， 然后按照 1:2 的比例加 4 μl 的 DNAfectinTM Plus 转染试剂， 轻轻地振荡混匀，静置20分钟，最后将混合物加入 6 孔细胞培养板中继续培养 24 小时或更长。 五、siRNA转染
转染前将待转染的细胞以 1 ~ 2 × 105每孔的密度种于 6 孔板中培养。24 小时后， 待细胞长至 50 % 时， 按LipofectamineTM 2000（Invitrogen， USA） 说明书进行转染： 转染前吸去含 FBS 的 DMEM 培养基， 加入 900 μl OPTI-MEM 培养基。在无菌的 1.5 ml 的离心管中加入 50 μl OPTI-MEM 和 LipofectamineTM 2000 转染试剂， 再将 siRNA 稀释到 50 μl OPTI-MEM 培养基中， 转染试剂与质粒比例为 2:1， 室温放置 5 分钟。 将两个离心管的稀释液混合在一起， 室温放置 20 分钟后， 加入 6 孔细胞培养板共孵 6 ~ 8 小时， 再换成 2 ml 含 10 % FBS DMEM 培养基继续培养 24 小时或更长。 六、免疫印迹分析WB
用 0.2 %胰蛋白酶/ 0.15 % EDTA 消化并收集细胞， 加入适量的细胞裂解液（10 mM HEPES， 2 mM EDTA， 0.1 % CHAPS， 5
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