植物反应器生产药用蛋白的研究进展
李世成
现代基因工程技术最初是建立在结构简单的微生物，尤其是以大肠杆菌为受体表达外源蛋白，用植物反应器生产药用蛋白的思路出于偶然。二十世纪八十年代，比利时PGS公司的科学家将一个神经肽（enkephalin，脑啡肽）编码基因转入烟草中表达，用意在于让瘾君子们不用抽烟，只需拿烟叶闻一闻或放在口中嚼一嚼即可过烟瘾，以此减少尼古丁对人体的危害及减少空气污染。他们在这个小肽基因两端设计了两个蛋白酶的酶切位点，将改造后的基因串联导入烟草细胞并成功获得再生植株，结果小肽以多聚体的形式表达存在，用胰蛋白酶和羧肽酶作用后获得了神经肽，每粒种子在200nmol。虽然，他们的目的最终没能达到，因为神经肽要经血液运输而起作用，在口腔及消化道内会被降解掉，但他们却意外地找到了一条利用转基因植物生产药用蛋白的途径，引起人们对此领域的关注。尤其是转基因植物生物反应器的研究和开发使植物能以极低的费用大量生产药用蛋白,具有极大的商业价值。。
植物反应器生产药用蛋白的优点
利用植物反应器生产药用蛋白已成为制药产业重点开发的热点领域。通过植物基因工程技术，在转基因植物中生产药用蛋白及多肽疫苗，具有微生物或动物反应器不可替代的独特优点（见表1）。它们不仅可以对真核生物蛋白进行准确的糖基化、酰氨化、磷酸化、亚基的正确装配等翻译后加工，使表达产物具有良好的生物活性和较低的免疫原性，而且也不像细菌在发酵过程中那样由于产生不溶聚合物—包涵体，而需要将它们重新溶解并折叠成天然蛋白质，这一过程所需要的成本很高；不仅如此，植物反应器也不会像动物反应器那样含有人类的潜在病原或其他污染等潜在的威胁；另外利用植物反应器，来源广，可进行大量田间栽培；转化植株系的种子易于储存，有利于重组蛋白的生产和运输；投资小，成本低。据推算，利用转基因植物生产药用重组蛋白的成本，仅为利用大肠杆菌发酵生产成本的 1／10～ 1／50。
表1 微生物、动物和植物反应器的比较 原核微生物反应器 真核蛋白翻译后加工的能力有限； 植物反应器 上游生产成本较低； 动物反应器 细胞培养需要用胎牛血清作为生长培养基，以及从培养上清中提取，成本昂贵； 细菌发酵常形成不溶聚合物或回收率低； 基因转化容易、成功率高、周期短、转基因动物生长繁殖、饲养条表达量高、提纯容易、收效快（少于两年）； 宿主菌的表达药物种类及表达量有限； 转基因植物自交后得到的同质后代的遗传性状稳定；进而在植物体内件及营养要求高； 基因转化难度大、转化成功率低、生产药物等待周期长（牛积累多基因； 噬菌体等污染造成倒灌的威胁； 下游加工复杂、成本高； 发酵常常需庞大的设备投资。
植物反应器生产药用蛋白研究进展
不存在噬菌体污染造成倒灌的威胁； 可食药物节省下游加工开支； 需要7年，羊需要3年）； 动物反应器的污染问题； 转基因动物易产生社会和伦理问题。 近20年来，随着植物基因工程的迅速发展，在植物抗虫、抗病毒和品质改良等方面已取得了举世瞩目的成就，同时利用转基因植物生产药用蛋白等为攻克医药难题也开辟了新的天地。科学家正逐渐把药物的生产从微生物转向植物，在这方面许多国家竞相研究。据不完全统计，目前已有几十种药用蛋白或多肽在植物中成功表达，一些研究机构或公司已开始从这些药物蛋白的生产中获得了巨大经济效益。
1、植物抗体
自从十几年前转基因烟草成功地表达免疫球蛋白的重链和轻链基因并组装成功以来,植物已经能够生产完整的IgG和IgA分子,分泌型IgG 和IgA 分子,单链可变区片段(scFv),Fab片段和重链可变区以及双特异性抗体(通过具柔性的肽键接头连接到一起),膜锚定抗体以及嵌合型的IgG和IgA 分子等不同类型抗体。应用植物生产单克隆抗体具有极大的市场潜力,获得的价格低廉的单克隆抗体在人类及牲畜的疾病治疗中将发挥巨大的作用。
目前已经成功地获得具有潜在医疗价值的植物抗体。主要有转基因烟草生产针对腐蚀牙齿的致病原Sreptpcpccus mutans 抗体IgG-IgA、人抗疱疹病毒(antiherpessimplex virus) 的抗体、针对癌胚抗原(carcinoembryonic antigen ,CEA) 的抗体、利用植物病毒载体侵染烟草瞬时表达淋巴瘤特异的疫苗等植物抗体全面用于诊断和治疗需要解决的主要问题包括产品的数量和质量、下游纯化工艺、糖基化等。通过调节表达元件、优化密码子以及提高抗体的稳定性可提高表达系统中重组抗体的积累水平。
重组蛋白在植物体内的糖基化 (glycosylation)方式与在人体内不同，这一问题近年来引起人们的关注，因为不同模式的糖基化会对人体形成免疫原性。一些专门的研究工作就是针对如何消除这种免疫原性的，如在不需要糖基化仍具有抗体活性的情况下，将抗体中有关植物N-糖基化的识别序列去除。对于高尔基体介导的糖基化，只要在抗体的C末端附加内质网滞留信号肽 KDEL，就可避免糖基化。另一种非常理想的方法是将植物糖基化方式转变为适合人体的糖基化，如将人的β-1,4-乳糖基转移酶（galactosyl transferase）转化烟草， 然后再与表达鼠抗体的烟草杂交，其后代产生的抗体就完全适合于人体了。这有助于消除对植物抗体作为人类药物可能存在免疫原性和致敏性等问题的忧虑。而且人类食物中普遍存在植物糖蛋白,因此对多数人而言,植物抗体的应用不会存在危险。
2、口服疫苗
转基因植物生产口服疫苗的前景非常诱人。在植物组织内合成某种致病原的关键免疫原性蛋白,然后作为可口服的亚单位疫苗给人和牲畜服用,人或动物的体内就会产生相应的抗体,具有抵抗该致病原的能力。
迄今为止,在植物中表达用于疫苗研究的病原基因主要有乙肝疫苗、大肠杆菌热敏肠毒素B 亚单位(LT—B) 基因 、霍乱弧菌毒素B亚单位(CT—B) 基因 、Norwalk 病毒衣壳蛋白疫苗、猪传染性胃肠炎病毒S 糖蛋白(TGEV—S) 基因 、口蹄疫病毒VP1蛋白(MDV—VP1) 基因、狂犬病病毒G蛋白基因 、兔出血病病毒(RHDV) VP60 蛋白基因等。另外结核杆菌分泌蛋白MPT64 基因在胡萝卜中获得了表达 ,轮状病毒结构蛋白vp4 、vp7 基因分别在马铃薯中获得了表达。
与注射疫苗相比,口服疫苗成本低、便于管理,是一种很有市场前景的大众免疫防护方式。口服疫苗还能够提高黏膜免疫力,提高对通过黏膜表皮进入人体的传染性因子的抵抗能力。目前对于口服疫苗的主要忧虑在于:蛋白质成分在胃肠中的降解是否在引发免疫反应之前。为了防止降解,人们利用重组微生物,脂质体以及转基因植物组织运送这些蛋白质,使这些蛋白质能够完整地到达肠部,引发免疫反应。目前已开发了几种有效的制剂，如生物胶丸。
另外，表达水平一直是关注的焦点。在现有的研究中,外源基因所表达的重组蛋白大约只占植物中可溶性蛋白的0.01%～0.37% ,即使以高表达量者为标准,此表达量作为疫苗仍然很低。那么如何提高转基因植物的抗原蛋白产量?针对这一问题,解决方法是通过对目的基因的修饰，如附加先导序列和poly（A）信号、优化密码子以适应植物系统或通过转基因植物与各种遗传背景杂交，都可提高表达水平。
表达产物在细胞中的定位也很重要，关系到转译后加工及产品的稳定性。对于亚单位疫苗而言,适宜表达部位是细胞表面、内质网以及高尔基体。人们还将疫苗基因与植物病毒表面蛋白基因融合构成瞬时表达系统,也得到了较高的表达水平。还有一个相关的策略是用来抵抗自身免疫疾病:利用转基因植物表达自身抗原作为口服疫苗,服用较大剂量的自身免疫原产生免疫耐受,进而达到抑制自身免疫疾病的发生。这一策略已经在治疗糖尿病的小鼠模型中获得了成功。
3、其他蛋白质
生产具有药学活性的植物蛋白和多肽是近年来转基因植物应用的另一迅速发展的领域。大量研究表明，人体内含量甚微但具有重要临床价值的蛋白或多肽也可在植物系统中表达。如人生长激素、人血清白蛋白、人干扰素β、人蛋白C、人表皮生长因子、红细胞生长素、脂肪酶、乳铁蛋白、水蛭素、胶原蛋白等。
目前生产实践中面临的主要问题仍是表达水平过低。编码人源蛋白质的基因在植物中的表达量很低:人血清白蛋白(human serum albumin)占植物TSP的0. 020%；人蛋白C(human protein C)占0.001%；红细胞生成素(erythropoietin ,EPO) 占0.003 %；人干扰素β(human
利用植物反应器生产药物蛋白及疫苗的研究进展
