SRAP与SSR分子标记在柳枝稷杂种鉴定中的比较分析
张婧1，黄琳凯1＊，ZHAO Bing－yu2，张新全1，严海东1，蒋晓阳1
【摘 要】摘要：利用SRAP标记和SSR标记对柳枝稷杂交种进行鉴定，比较2种标记在柳枝稷杂种鉴定方面的效率和准确性，为柳枝稷乃至异花授粉多倍体植物的杂种真实性鉴定提供科学依据。分别利用SRAP与SSR标记技术对柳枝稷165个杂交种单株和亲本DNA进行扩增，分析杂交种与亲本扩增的多态性条带数，并鉴别真假杂交种。与SRAP标记相比，共显性的SSR标记具有高效性，本研究中仅用1对SSR引物就鉴别了所有杂交后代的真实性，多态性条带比率为100%。而显性SRAP标记用了6对才能鉴别所有杂交后代的真实性，多态性条带比率为40%，相对较低。 【期刊名称】草业学报 【年(卷),期】2012(021)005 【总页数】6
【关键词】柳枝稷；SRAP；SSR；杂种鉴定
柳枝稷 （Panicum virgatum）是一种高大的多年生草本C4植物，具有适应性广、生物质产量高和对环境友好等优点，在生态改良和新能源开发方面潜力巨大［1］。开发清洁可再生的生物质能源意义深远，美国能源部将柳枝稷作为纤维素类能源植物中的模式植物，而我国对柳枝稷的应用和研究尚处于起步阶段，选育适合我国栽培的柳枝稷品种可加快能源植物产业的发展。
品种选育和改良可有效提高其能量转化率和经济效益，而分子育种可大大加快柳枝稷的育种进程。杂种鉴定是遗传育种的基础工作之一，鉴定出的真杂种可为杂交育种和遗传图谱构建等提供重要依据。柳枝稷是异花授粉多倍体植物
［2］，在杂交过程中由于隔离不严或者具有一定的自交率等原因，不同来源花粉可导致种子生物学混杂，因此对杂交后代的真实性鉴定十分必要。分子标记技术由于具有快速简便，可以实现高通量等优点，被广泛应用于各种植物的杂种鉴定和杂种纯度分析工作中，如柚（Citrus maxima）［3］，辣椒（Capsicum annuum）［4］，枣（Ziziphus jujuba）［5］等。其中简单重复序列（simple sequence repeat，SSR）标记技术具有共显性、结果可靠、重复性好的特点，在杂种鉴定，遗传多样性研究，遗传图谱构建等方面应用广泛［6－9］。表达序列标签（expressed sequence tags，ESTs）的发展促进了SSR的应用，并且快速增长的ESTs数据已成为SSR标记的重要开发来源。与基因组SSR相比，EST－SSR的开发不需要构建DNA文库及克隆测序等步骤，更为节省成本和时间［10］。2001年美国加州大学 Li和 Quiros［11］发明了相关序列扩增多态性（sequence－related amplified polymorphism，SRAP）技术，是一种新型的基于PCR的随机引物标记系统。SRAP属于显性标记，具有多态性高，操作简便等优势，已经被广泛运用于遗传多样性分析和杂种鉴定工作中，如多花黑麦草（Lolium multiflorum）［12］、结缕草（Zoysia japonica）［13］、紫花苜蓿（Medicago sativa）［14］、柱花草（Stylosanthes guianensis）［15］等植物。但是这2种分子标记在柳枝稷杂种鉴定中的比较分析，尚未见报道。
本研究分别利用SRAP和SSR标记技术对柳枝稷165个杂交后代进行杂种真实性鉴定，分析显性标记SRAP与共显性标记SSR在杂种鉴定中的扩增多态性以及鉴定准确性和效率，为应用分子标记技术快速鉴定柳枝稷乃至异花授粉多倍体植物的杂种真实性提供依据，且鉴定得到的真杂种可以用于构建柳枝稷遗
传图谱、重要性状的QTL定位等研究。
1 材料与方法
1.1 供试材料
亲本Alamo和Dacotah，以及以Alamo为父本，Dacotah为母本杂交得到的165株F1植株，编号为DAT1～DAT165。杂交后代和亲本均盆栽于温室中。其中Alamo属于低地生态型，植株较高大，茎秆粗壮；Dacotah属于高地生态型，茎秆较细，分枝较多。 1.2 基因组DNA提取
本实验于2010年4月进行。以柳枝稷幼叶为材料，采用植物基因组DNA提取试剂盒（天根公司）提取DNA。提取的DNA用0.8%的琼脂糖凝胶电泳进行纯度的检测。将DNA样品置于－20℃冰箱保存。待开始实验时，将各个DNA样品取出一部分稀释至20ng／μL，放于4℃冰箱保存并备用。 1.3 SRAP分析
SRAP标记引物序列见Li和Quiros［11］的报道。SRAP标记共有上游引物12条，下游引物19条，两两组合为228对引物。用亲本Alamo和Dacotah对SRAP引物进行父本特征带的筛选。PCR扩增反应体系为20μL：DNA 2μL（20ng／μL），2×Taq PCR MasterMix（天根公司）10μL，上下游引物各1μL（10μmol／L），灭菌水补齐20μL。
SRAP－PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，35℃复性1min，72℃延伸1min，共5个循环；94℃变性1min，50℃复性1min，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min，－20℃保存［16］。以上PCR反应在PTC－200PCR（Bio－Rad）仪上进行。最后PCR扩增产物采用
SRAP与SSR分子标记在柳枝稷杂种鉴定中的比较分析
