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维生素C生产工艺综述
摘 要:介绍了维生素C 的性质、功能和用途。综述了维生素C 生产技术的演变过程和发展趋势。着重探讨了微生物发酵法的生产工艺进展。介绍了二步发酵法的研发现状,探讨了2 - 酮基- L- 古龙酸的分离提取工艺。展望了我国维生素C 生产技术的前景。
关键词:维生素C ,功能,二步发酵法,发酵,2 - 酮基- L —古龙酸,分离提取
The Overview on the Production Process of Vitamin C
Abstract : Characters , functions and uses of vitamin C are introduced. Developmental process and trend of industrial technology on vitamin C are reviewed. Advances in industrial technology of microbiological fermentation method are discussed emphatically. After present situation of R &D of the two steps fermentation method is introduced , the separation and purification processes of 2- keto-L- gluconic acid are discussed. The direction of industrial technology on vitamin C in China is previewed. ?
Key words : Vitamin C ,Function , Two steps fermentation method ,Fermentation , 2- keto-L-gluconic acid , Separation and extraction
维生素C(vitaminC ,以下简称Vc) 又名L - 抗坏血酸(L - ascorbicacid) ,是一种人体必需的水溶性维生素。Vc 广泛存在于生物组织中,在新鲜水果、蔬菜和动物肝脏等中的含量尤为丰富。绿色植物能够自己合成Vc ,而人和许多动物由于肝脏中缺少一种古洛内酯氧化酶,因而不能自己合成,必须从外界摄取。
1.维生素C 的性质、功能和用途
性质
纯维生素C 在常温下为无色晶体,味酸,易溶于水。Vc 在结晶状态尚稳定,而在水溶液中则很不稳定,容易为加热、氧化所破坏。 》
L-抗坏血酸具有较强的还原性,在体内经抗坏血酸氧化酶的作用可脱氢氧化成L-脱氢抗坏血酸,该脱氢反应是一个可逆反应。还原型的L-抗坏血酸和氧化型的L-脱氢抗坏血酸均具有生理活性,它们构成的一对氧化- 还原系统,在细胞代谢中起着重要的生理作用[1 ] 。
功能与用途
Vc 在人体中具有广泛的生理作用:1) 参与体内氧化还原反应[2 ] ;2) 对抗自由基损伤[3 ] ;3) 改善机体免疫功能[4 ] ; 4) 参与胶原蛋白和细胞间质的合成[2 ]
;5) 参与神经递质的合成[2 ] ;6) 参与氨基酸代谢与铁代谢[2 ] ;7) 抑制血小板及白细胞活化[2 ] ;等等。因此,Vc 在坏血病[5 ] 、感冒、心血管缺陷、高胆固醇、糖尿病、精神抑郁症[6 ] 、危重型克山病等疾病的临床治疗中均具有重要的用途。此外,Vc还可以用作食品添加剂、饲料添加剂、某些农作物的催熟剂、化妆品工业防锈剂[6 ] ,等等。
的生产方法
莱氏法
莱氏法是1933年德国化学家Reichstein等发明的最早应用于工业生产VC的方法。该法以葡萄糖为原料,经催化加氢制取D - 山梨醇,然后用醋酸菌发酵生成L - 山梨糖,再经酮化和化学氧化,水解后得到2 - 酮基- L - 古洛糖酸(2 - KLG) ,再经盐酸酸化得到VC。莱氏法生产的VC产品质量好、收率高。由于生产原料廉价易得,中间产物的化学性质稳定,至今仍是许多国外VC生产商,如Roche公司、BASF / Takeda 公司和E. Merck公司等厂商采用的主要工艺方法。但是莱氏法也存在不少缺陷,诸如生产工序多、劳动强度较大,使用大量有毒、易燃化学药品,容易造成环境污染等。为此,自20世纪60年代起,各国学者一直致力于莱氏法的改进。其过程如图1所示：
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H2/ Ni 醋酸杆菌 丙酮/ H2SO4
D-葡萄糖 D-山梨醇 L-山梨糖 双丙酮-L-山梨糖 高压 [O]
水解 化学转化 双丙酮-2-酮基-L-古洛糖酸 2- KLC Vc NiSO4
图1 莱氏法生产Vc 的工艺流程
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二步发酵法
我国的混合菌发酵工艺是20 世纪70 年代由中国科学院微生物研究所和北京制药厂共同建立的，包括2 个发酵步骤，故称两步发酵法。第一步是在醋酸杆
菌作用下将D－山梨醇氧化为L－山梨糖，俗称醇糖转化，目前国外对其相关基因和转化机制的研究已经比较清楚； 第二步是在一种混合菌系的作用下将L－山梨糖进一步氧化为KGA，俗称糖酸转化[7]。上述混合菌系包括2 种微生物，直接负责山梨糖生物氧化的微生物俗称小菌，最初曾被鉴定为氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans）， 最近Urbance等[8] 经系统分类学鉴定对其重新命名为普通酮古龙酸菌（Ketogulonigenium vulgare）。另一种微生物俗称大菌，本身不能转化山梨糖，作为伴生菌起到辅助小菌生长和产酸的作用。许多微生物具有这种伴生菌的作用， 生产中常用的有腊状芽孢杆菌（Bacillus cereus）、巨大芽孢杆菌（B．megaterium）、苏芸金芽孢杆菌（B．thuringiensis）等。目前国内Vc 生产厂家都采用混合菌发酵法， 该法是惟一成功应用于大规模Vc 工业生产的微生物转化法，具有糖酸转化效率高的突出优势。目前我国Vc 生产规模占世界总生产规模的2 ／ 3，其中80％的产品用于出口，是我国医药领域的支柱产业。混合菌发酵法在国内的成功应用也引起了国外的广泛关注。1986 年，我国的两步发酵法向瑞士Hoffmann La－Roche 公司进行了技术转让。其过程如图2所示：
H2/ Cat 醋酸杆菌 大菌、小菌
D - 葡萄糖 D - 山梨醇 D - 山梨糖 2 – KLG
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混合发酵 化学转化 Vc
图2二步发酵法生产Vc 的工艺流程
大、小菌关系的研究进展
二步发酵法中的第二步发酵是由氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans） 和巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）混合发酵完成的，前者为产酸菌俗称小菌，但单独培养传代存活率及产酸能力较低。后者为伴生菌俗称大菌，它不产酸，混合培养时产酸显著提高。混合发酵中大小菌两者关系复杂，一直是国内外学者研究的热点。
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魏东芝[9]曾提出大菌为小菌提供某种生长因子促进小菌生长的设想。
冯树等[10]研究证实，大菌胞内液和胞外液均可促进小菌生长，大菌胞外液中具有该作用的组分分子量在100kDa以上；大菌胞外液具有促进小菌产酸，其胞内液无该作用；大菌胞外液中具有该活性作用的组分为30-50kDa和大于100kDa两个部分。其中前者是一种含铁和锌的蛋白质，该活性蛋白的形成规律和作用机制尚在探索中。
焦迎晖[11]等通过分析Vc二步发酵过程中活菌产酸量、糖酸转化活力等，证明了大菌的胞外液或胞内液对小菌休止细胞的糖酸转化活力并没有直接影响，即大菌的作用仅仅是促进小菌的生长，而对产酸的促进作用是因使小菌密度提高的结果。目前，大、小菌的详细混生机制尚未完全明了，仍需人们进一步探索。
菌种选育的研究
有关二步发酵法中的第二步发酵过程的菌种选育一直是微生物发酵法生产维生素C研究的热点课题之一，我国学者作了大量的工作。
尹光琳等[7]采用紫外照射、化学诱变和原生质体融合等方法选育得到的新组合菌系SCB 329—SCB 933的发酵周期仅40—50h，产酸达115—130mg/mL，转化率约为90%。
焦鹏等[12]运用SMA探针技术HB—HG影印技术筛选得到了一株蛭弧菌J26，摇瓶发酵产生2—KLG的发酵单位为50—60 mg/mL。通过优化发酵条件，该菌株的发酵单位已达到%—%。
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[13]
许安等利用离子注入技术选育出的2—KLG高产菌系IPPM—1028，其转化率较出发菌M—2980提高%，发酵周期为60—64h，2—KLG浓度可达70 mg/mL左右，转化率为95%。
李越中[6] 采用含pUB 110质粒的小菌转化子（KmrSts）与Q132（KmsStr）大菌进行原生质体融合，获得可连续传代10代以上的小菌，这将为实现小菌的单独培养以及对小菌的遗传学研究打下基础。
陈建华等[14]用配对法筛选得一株氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans）10—3的优良伴生菌短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）97002,L—山梨糖的转化率达90%左右。初步尝试两菌属间原生质体融合。
尽管有关二步发酵法第二步发酵过程的菌种选育的研究进行了很多，但仍处于实验室研究或小试阶段。
发酵工艺条件的研究
微生物发酵是一个极其复杂的生化反应过程。基质浓度、温度、PH等因素对微生物的生长和产物的形成都会产生直接影响。国内一些学者对二步发酵法工艺进行了深入的研究。
魏东芝等[9]研究了VC二步发酵过程的动力学，通过测定发酵中大小菌生长规律及基质和产物的变化，建立了简化的动力学模型，在一定程度上揭示了2KLG发酵系统的本质特征，为分析发酵过程，指导生产及实现生产连续自动化奠定了基础。
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张忠泽[15]等通过优化通气、温度和金属离子等环境因子，显著改善了二菌协同共生效果，醇酸转化率提高了%，发酵周期缩短了。
针对L—山梨糖浓度不高的问题，尹光琳等[7]通过对新组合菌系SCB329—SCB933批加L—山梨糖技术的研究，既避免了高糖对菌体生长的抑制作用，又能利用菌株的优良特性，使底物浓度提高到14%。
康学真[16]等通过对VC二步发酵中大小菌的比例对产酸的影响，测定和分析了零级、一级、二级种子的生长曲线，得出了各级种子的最适培养时间、零级种子培养最初接种量及大小菌的接种比例，对实践有指导作用。
蒋宇扬、张成刚[17]研制了几种稀土元素化合物，考察了它们对2—酮基L—古龙酸还原酶（KGR）及在L—山梨糖发酵中对2—KLG产酸的影响，摇瓶试验结
果表明，在L—山梨糖发酵中加入稀土元素化合物，发酵时间缩短6h，2—KLG产酸量提高超过6 mg/mL。
李越中[6]采用聚乙烯/海藻酸钙包埋对大、小菌进行固定化，获得高于游离菌的产酸量；并采取种子液活化的方法使固定化细胞半衰期延长至10批次。
提取工艺
二步发酵法两次发酵以后,发酵液中仅含8 %左右的2 - KLG,而残留菌丝体、蛋白质、多糖或悬浮微粒等杂质的含量却很高。这给2 - KLG的分离提纯带来了很大困难,致使后处理费用占总成本的比例较大。目前, VC工业生产中常用的2 - KLG的分离提纯方法有加热沉淀法、化学凝聚法和超滤法。
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(1)加热沉淀法
加热沉淀法是2 - KLG分离提纯的传统工艺,分离手段较为落后。此工艺通用氢型树脂,调pH至蛋白质的等电点后加热除蛋白。采用此工艺会造成有效成分在高温下降解损失,且发酵液直接通过树脂柱,造成树脂表面污染,降低树脂的交换容量和收率。两次通过树脂柱带进了大量水分,也增大了浓缩耗能。
(2)化学凝聚法
化学凝聚法是通过加入化学絮凝剂来除去蛋白质、菌体、色素等杂质,避免了加热沉淀时有效成分的损失。季光辉等[ 18 ]采用化学凝聚法对VC发酵液进行预处理,使2 -KLG的滤液质量提高,提取前步收率提高5. 2% , VC总收率提高2. 5%以上。陈雷等[19 ]以壳聚糖为主凝剂,聚丙烯酰胺为助凝剂,通过化学凝聚法除蛋白工艺,提取收率由原来的76%提高到82% ,古龙酸优级品率由原来的35%提高到60% ,成本比原来降低20%。
但是,化学凝聚法也存在不足,主要表现在处理后的发酵液离心后所得的上清液中仍然存在一定量的蛋白,如发酵液染菌则处理的效果更不明显,上清液浑浊,严重影响产品的质量和收率。此外,所用的化学絮凝剂也可能对环境造成污染。
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(3)超滤法
超滤是一种新兴的膜处理技术,此法具有操作方便、节能、不造成新的环境污染等优点,因此在2 - KLG的分离提纯中的应用日益广泛[ 20 ]。此法与加热沉淀法不同的是,可在常温下操作,可减少有效成分的损失; 在用膜除蛋白的过程中,无任何新的化学物质加入,可减少对树脂的污染和损耗,降低酸碱用量,减少三废排放。与化学凝聚法不同的是,在处理染菌的发酵液时仍可达到较好的处理效果。我国的东北制药厂1995 年从丹麦引进目前全国最大膜面积的平板超滤装置后, 2 - KLG的分离提纯成本比原先的化学凝聚法节约了600万元,其收率和生产的自动化、连续化程度也明显提高[ 21]。
随着新型膜材料技术的开发,如陶瓷膜、不锈钢膜等的应用,超滤法的应用效
维生素C生产工艺综述
