目录
1 材料与方法 ........................................................................................................................................................ 1 1.1 植物材料以及菌株的保存与培养 ............................................................................................................... 1 1.2 Trizol法提取Total RNA ........................................................................................................................ 1 1.3 Oligo（dT）磁珠纯化mRNA ............................................................................................................... 1 1.4 三框cDNA的合成 ................................................................................................................................... 2 1.5 cDNA均一化与小片段去除 .................................................................................................................... 4 1.6 双链cDNA与pGADT7（lineared）同源重组 ................................................................................ 6 1.7 质粒转化大肠杆菌 .................................................................................................................................... 7 1.8 文库鉴定 ..................................................................................................................................................... 7 1.9 文库质粒大抽 ............................................................................................................................................ 8
2 结果与分析 ........................................................................................................................................................ 9 2.1 RNA质量较好无降解 ............................................................................................................................... 9 2.2 ds cDNA合成 ........................................................................................................................................ 10 2.3 ds cDNA均一化与去除小片段 ........................................................................................................... 11 2.4 克隆计数 .................................................................................................................................................. 11 2.5 文库质量鉴定 ......................................................................................................................................... 12 附录 ...................................................................................................................................................................... 14
1．材料与方法
1.1 植物材料以及菌株的保存与培养 1.1.1 植物材料的保存
盐穗木由客户提供，存放于-80℃超低温冰箱。
1.1.2 菌株的保存与培养
大肠杆菌（Eschrichia coli）菌株TOP10于LB培养液摇菌后保存成20%的甘油菌于-80℃
冷冻保存。大肠杆菌于37℃培养箱中培养。
1.2 Trizol法提取Total RNA
1） 研钵研棒药勺用液氮预冷，样品在液氮中研磨成粉末状，转移到离心管中；
2） 按50-100 mg/ml trizol加入trizol，充分振荡混匀。室温静置5 min，使其充分裂解； 3） 按200 μl/ml trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置10 min；
4） 4℃ 12000 rpm离心15 min，吸取上层水相至一新的离心管中，按500 μl/ml trizol加入异丙醇混匀，-20℃放置10 min；
5） 4℃ 12000 rpm离心10 min，弃上清，此时RNA沉淀于管底；
6） 按1 ml/ml trizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。4℃ 8000 g 离心5 min，尽量弃去上清；
7） 重复步骤6一次；
8） 室温晾干或真空干燥5-10 min，用29 μl RNase-free ddH2O和1 μl的RNase inhibitor溶解RNA样品；
9） 分别吸取2 μl进行电泳检测与浓度测定。 1.3 Oligo（dT）磁珠纯化mRNA
1） RNase-free PCR管中，用RNase-free H2O将10 μg总RNA稀释至50 μl；
2） 吸取50 μl磁珠加入到总RNA样品中，吸打混匀；将样品置于PCR仪中，65℃ 5 min，25℃ 5 min，使mRNA结合到磁珠上；
3） 将样品置于磁力架上，待溶液澄清后，移除上清；
4） 将样品从磁力架上取下，加入200 μl wash buffer混匀，置于磁力架上，待溶液澄清后，移除上清；
5） 将样品从磁力架上取下，加入50 μl Tris buffer重悬磁珠，置于PCR仪中，80℃ 2 min，将mRNA洗脱下来；
6） 加入50 μl binding buffer，吸打混匀，室温放置5 min，使mRNA结合到磁珠上； 7） 将样品置于磁力架上，待溶液澄清后，移除上清；
8） 将样品从磁力架上取下，加入200 μl wash buffer混匀，置于磁力架上，待溶液澄清后，移除上清；
9） 加入10 μl RNase-free H2O，吸打混匀，80℃ 2 min，立即置于磁力架上，待溶液澄清后，小心吸取上清至一新的RNase-free PCR管中。
1.4 三框cDNA的合成
1.4.1 mRNA逆转录成单链cDNA 1） 在0.2 ml PCR管中按下表加入试剂：
表1 逆转录体系各组分及用量
Reaction Component mRNA（1 ng-500 ng） CDS III/3' PCR Primer SMART IV Oligonucleotide DEPC H2O Total Volume(μl)
per rxn X μl 1 μl 1 μl up to 5 μl 5 μl
2） 72℃ 3 min，立即置于冰上，按下表加入试剂：
表2 逆转录体系各组分及用量
Reaction Component 5×First-Strand Buffer DTT (20 mM) dNTP Mix (10 mM)
MMLV Reverse Transcriptase Total Volume(μl)
3） 42℃ 90 min，然后70℃ 15 min终止；
4） 冷却至室温，加入1 μl RNase H，37℃ 30 min，此步骤产物可存放于-20 ℃； 1.4.2 cDNA的扩增与纯化 1.4.2.1 cDNA的扩增
1） 在0.2 ml PCR管中按下表加入试剂：（P1、P2、P3引物为三框引物）
表3 cDNA扩增体系各组分及用量
Reaction Component 上述产物 ddH2O 2×PCR Mix P1/P2/P3-F P4-R
Total Volume(μl)
2） 按下表程序进行PCR，PCR结束后取2 μl进行电泳检测；
表4 PCR程序
per rxn 2 ?l 19 μl 25 μl 2 ?l 2 ?l 50 μl per rxn 2.0 ?l 1 μl 1 μl 1 μl 5 μl
95℃ 3 min 95℃ 15 s 60℃ 15 s 72℃ 6 min 72℃ 10 min
1.4.2.2 cDNA的纯化
1） 用DNA Clean Beads对PCR产物进行纯化；
2） 提前30 min将磁珠液从4℃冰箱中取出，静置使其恢复至室温；
3） 颠倒或旋涡振荡混匀磁珠液，吸取1.2倍样品体积的磁珠液加入到DNA样品中，移液枪轻轻吸打10次充分混匀；
4） 室温孵育10 min，使DNA结合到磁珠上，将样品置于磁力架上，待溶液澄清后（~5 min），小心移除上清；
5） 样品始终保持在磁力架上，加入200μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠（不要搅动磁珠），室温孵育30 s，小心移除上清；
6） 重复步骤5一次;
7） 样品始终保持在磁力架上，室温下开盖干燥磁珠5-10 min;
8） 将样品从磁力架上取出，加入适量30-50 μl无核酸酶ddH2O，旋涡振荡或吸打混匀，室温静置2 min，置于磁力架上待溶液澄清后（~5 min），小心吸取上清至一个新的无核酸酶EP管中。
1.5 cDNA均一化与小片段去除 1.5.1 cDNA均一化
1） 将下列试剂于0.2 ml PCR管中混匀
表5 杂交体系各组分及用量
Reaction Component
per rxn
30 cycles
ds cDNA (1 ?g) 2×Hybridization buffer ddH2O
Total Volume(μl)
2） 将上述溶液平均分成4份,置于0.2 ml PCR管中； 3） 将PCR管在PCR仪上98°C放置2分钟；
4） 将PCR管迅速转移到准备好的68°C PCR仪中5 h； 5） DSN 消化；
6） 在杂交完成前准备好以下浓度的DSN酶：
X ?l 8 μl X μl 16 μl
将1 ?l DSN storage buffer和1 ?l DSN酶混匀，标记为1/2 DSN； 将3 ?l DSN storage buffer和1 ?l DSN酶混匀，标记为1/4 DSN； 直接取1 ?l DSN storage buffer，标记为control； 7） 68°C预热 DSN master buffer； 8） 按下表依次加入试剂后，混匀
表6 消化体系各组分及用量
Reaction Component 杂交后的cDNA
2×DSN master buffer (68°C预热)
DSN solution （分别为DSN，1/2 DSN，1/4 DSN，control）
Total Volume(μl)
9） 将4个PCR管68°C反应25 min；
10） 在各管中加入10 ?l 2×DSN stop buffer，混匀；
10 μl per rxn 4 μl 5 μl 1 μl
11） 室温放置5 min，可于-20°C保存。 12） DSN消化后PCR放大；
13） 在四个PCR管中按下表依次加入试剂，混匀，分别标记为DSNP1，1/2 DSNP1，1/4 DSNP1，controlP1；
表7 消化后扩增体系各组分及用量
Reaction Component ddH2O
10×Advantage 2 PCR Buffer 50×dNTP Mix Primer M1
50×Advantage 2 Polymerase Mix
消化后产物（即DSN，1/2 DSN，1/4 DSN，control） Total Volume(μl)
15） 轻拍混匀各组分，稍稍离心后放到已预热（95°C）的PCR仪。 16） 按下表程序开始PCR：
per rxn 40.5 μl 5 μl 1 μl 1.5 μl 1 μl 1 μl 50 μl
表8 PCR程序
95℃ 1 min 95℃ 15 s 66℃ 20 s 72℃ 3 min
17） 使用Clontech CHROMA SPIN?+TE-1000 Columns（TAKARA，636079）进行小片段去除。根据说明书进行操作。
1.6 双链cDNA与pGADT7（lineared）同源重组 1） 在冰上于0.2 ml PCR管中按下表加入试剂：
表9 同源重组体系各组分及用量
Reaction Component ds cDNA pGADT7
per rxn 2 ?l 50-200 ng
5×CE II Buffer Exnase II ddH2O
4 μl 2 μl Up to 20 μl
2） 在37℃反应30 min，置于冰上。
3） 在一无菌的1.5 ml离心管中按下表加入试剂：
表10 核酸沉降体系各组分及用量
Reaction Component
11 cycles
上述产物 核酸助沉剂 100% ethanol
4） 混匀后于-20℃放置30 min，13000 rpm离心15 min，弃去上清； 5） 加入1 ml 75%乙醇洗涤沉淀，8000 rpm离心2 min，弃去上清； 6） 重复步骤5一次；
20 μl 2 μl 55 μl
7） 室温下晾干5-10 min，加入10 μl TE buffer溶解沉淀，反复吸打60次。 1.7 质粒转化大肠杆菌
1） 将2 mm电击杯于冰上预冷，将10 μl重组产物和50 μl电转感受态混匀后转移到电击杯中，注意不要产生气泡；
2） 设置电击仪参数，U=2.5 kV，电转结束后立即加入2 ml 液体SOC培养基，转移到新的15 ml离心管中，37 ℃振荡培养1 h；
3） 取10 μl菌液稀释10000倍后，从中取100 μl涂布于含Amp抗生素的LB平板，37℃倒置过夜培养。剩余菌液加入甘油至终浓度为20%即为文库菌液；
1.8 文库鉴定
1） 文库滴度（cfu/ml）=克隆数/0.1ml×10000
文库库容（cfu）=滴度×菌液体积
2） 克隆鉴定，随机挑取24个克隆作为模板，按如下体系加入试剂
表11 菌落PCR体系各组分及用量
Reaction Component ddH2O
per rxn 8 μl
2×PCR Mix T7-F 3’AD
Total Volume(μl)
3） 按如下程序PCR
表12 菌落PCR程序
95℃ 3 min 95℃ 15 s 55℃ 15 s 72℃ 1 min 72℃ 5 min
PCR结束后，从中取出10 μl进行电泳检测； 1.9 文库质粒大抽
10 μl 1 μl 1 μl 20 μl
25 cycles
采用高纯度质粒大提试剂盒（Tiangen，DP116），并参考其说明书进行质粒提取。
1） 吸取100 μl文库菌液，接种到100 ml含Amp抗生素的LB培养基中（500 ml三角瓶），30℃ 220 rpm培养至OD600=1；
2） 用50 ml离心管收集菌体，室温8000 rpm离心3 min，尽量吸去上清，为确保上清全部吸去，可用吸水纸吸去壁上的水滴；
3） 加入10 ml溶液P1（确保加入RNase A），吸打或涡旋振荡彻底悬浮沉淀； 4） 加入10 ml溶液P2，立即温和地上下混匀6-8次，室温放置5 min；
5） 加入10 ml溶液P4，立即温和地上下混匀6-8次，室温放置10 min，室温8000 rpm离心10 min；
6） 将溶液倒入过滤器中，过滤到一新的50 ml离心管中，加入0.3倍体积的异丙醇，混匀后以10 ml/次转移到吸附柱中；
7） 室温8000 rpm离心2 min，倒掉废液，重复直至上述溶液全部过柱；
8） 向吸附柱CP6中加入10 ml去蛋白液，室温8000 rpm离心2 min，倒掉废液； 9） 向吸附柱CP6中加入10 ml漂洗液，室温8000 rpm离心2 min，倒掉废液； 10） 重复步骤9一次；
11） 室温8000 rpm离心5 min，开盖于室温放置数分钟，彻底晾干乙醇； 12） 向膜中央加入1-2 ml洗脱液，室温放置5 min，室温8000 rpm离心5 min； 13） 将所得溶液转移到一新的1.5 ml离心管中，于-20℃保存，即为文库质粒。 2．结果与分析
2.1 RNA质量较好无降解
为了鉴定所提取的RNA是否能用于下游建库，从中分别吸取2 μl进行琼脂糖电泳检测和分
光光度计测量，结果显示，能清晰的看到28S和18S两条带，5S条带很弱甚至无，表明所提RNA完整性好，无降解（图1A）。OD260/OD280在1.8-2.2之间，表面RNA纯度高，OD260/OD230大于2，表明糖类、盐类、有机溶剂等去除干净（图1B）。因此，所提取RNA可用于下游建库。
图1 RNA提取
A. RNA电泳检测结果，M：Maker，1：600 mM NaCl处理12 h的同化枝组织RNA，2：600
mM NaCl处理24 h的同化枝组织RNA。B. 分光光度计测量RNA的结果。 2.2 ds cDNA合成
为了判断所获得的ds cDNA是否合成，PCR结束后取5 μl进行琼脂糖电泳检测，结果显示，
ds cDNA呈现弥散条带，表示合成的cDNA质量较好，各个大小的条带都有（图2）。
图2 ds cDNA合成
琼脂糖凝胶电泳检测ds cDNA的质量，M：Maker，1：P1-F/P4-R扩增 ds cDNA；2： P2-F/P4-R扩增 ds cDNA；3： P3-F/P4-R扩增 ds cDNA。
2.3 ds cDNA均一化与去除小片段
为了验证均一化与小片段是否去除，从纯化后的溶液里边吸取5 μl进行琼脂糖电泳检测，结
果显示，ds cDNA呈弥散条带，且无明显亮带，说明均一化成功。500 bp以下几乎看不到条带，表明小片段去除干净（图3）。
图3 琼脂糖凝胶电泳检测均一化与去小片段
琼脂糖凝胶电泳检测均一化与小片段去除效果，M：Maker，1：三种ds cDNA混合后纯化结果。 2.4 克隆计数
为了确定文库库容，从电转孵育后的菌液中吸取10 μl稀释10000倍，从中吸取100 μl涂
布与含氨苄的LB平板，37℃倒置过夜培养，第二天取出平板后，划线把平板平均分成4份，数其中一份的克隆数目，约为120个，得到平板上克隆约为480个，根据公式：文库库容（cfu/ml）=克隆数/涂布体积×稀释倍数，总克隆数（cfu）=库容×菌液总体积，得到库容为4.8×107，总克隆数为9.6×107（图4）。
图4 大肠杆菌菌落计数
大肠杆菌菌落平板，12 h后拍照，稀释倍数为10000，平板克隆数约为480个。 2.5 文库质量鉴定
为了检测所构建文库的条带分布如何，从平板上随机挑选24个克隆进行菌落PCR，引物为
T7-F/AD-R，PCR结束后取5 μl进行琼脂糖凝胶电泳检测，从图中可知，泳道5没有条带，其余泳道条带在1000 bp上下出现，说明文库片段平均大小在1000 bp（图5）。
图5 文库质量鉴定
大肠杆菌菌落PCR，M：Maker，1-24：随机挑取的24个克隆进行PCR，PCR结束后电泳。
附录
表1 本实验所用的引物 引物名称 CDS III/3' PCR Primer 序列（5’-3’） AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG SMART Oligonucleotide P1-F IV ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN CATATGGCCATGGAGGCCAGTGAATTCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGG P2-F CATATGGCCATGGAGGCCAGTGAATTCAAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGG P3-F CATATGGCCATGGAGGCCAGTGAATTCAAAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGG P4-R CATCTGCAGCTCGAGCTCGATGGATCCCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG Prime M1 T7-F AD-R AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT TAATACGACTCACTATAGGGCGAG GCACGATGCACAGTTGAAG 均一化 菌落PCR 菌落PCR ds cDNA扩增 ds cDNA扩增 ds cDNA扩增 ds cDNA扩增 逆转录 应用 逆转录 V：A，C or G；N：A，T，C or G；标红部分为pGADT7载体同源臂。
cDNA文库构建技术手册
