5 环丙沙星的间接竞争ELISA检测方法
5.1 原理：ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，可用于定性或定量分析。 5.2 方法
5.2.1 鸡肉样品处理
适量鸡肉（去除脂肪），剪碎后放入组织研磨器中，制成匀浆状；称取1g，移入5或15ml离心管内；加4mlPBS缓冲液，盖严，剧烈振荡10min；4000r/min离心10min，取上清于新管内为预处理样品溶液；取100μL预处理样品溶液/或试样溶液，加100μL保温液，混匀后取50μL用于检测；样品稀释倍数按10倍计。 5.2.2 样品脱脂
将预处理样品溶液加入等量水饱和的正己烷，充分振荡后，4000r/min离心5min，弃去上层溶液及油脂，在下层清液中再加入水饱和的正己烷重复脱脂一次。最后小心吸去上层溶液及油脂，下层清液即为试样溶液 5.2.3 步骤：
1) 用包被液将BSA-CPFX稀释至1ug/mL包被酶标板，100μl/孔, 4℃，过夜或37℃，2h； 2) 用pH 7.4的PBST洗涤三次，250uL左右，手摇，每次45s；
3) 环内沙星腹水抗体（1mg/mL）用保温液6万倍稀释；环丙沙星标准品（1mg/mL）用保温液按64、32、16、8、4、2、1、0 ng/ml稀释； 4) 先将各浓度标准品加入一列孔中（50ul/孔），再统一加稀释的腹水（50ul/孔），混匀后，37℃，45min； 5) 用PBST洗涤三次，同上；
6) 酶标羊抗小鼠IgG（HRP-羊抗鼠IgG，二抗）用保温液1：5000倍稀释，每孔100μl，37℃温育45min；用PBST洗涤四次，同上；
7) 加入底物溶液，每孔100μl，37℃温育20min，每孔滴加50μl终止液，酶联检测仪测定OD490值。 5.2.4 数据分析
以标准品浓度的常用对数为横坐标，以抑制率[（A标/A0）×%]为纵坐标绘制标准曲线，并根据曲线的具体情况选择最佳的拟合模型。
其中A0为零标准品孔OD值，A标为各浓度标准品孔OD值。
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实验二“生鲜牛乳质量评价”综合实验
设计内容：以市售生鲜乳样品为目标，参考课件、食品专业实验指导教材、乳品检验相关教材、相关食品检测国家标，主要针对取样方法、感官检验、理化分析（相对密度、酒精实验法测酸度）、微生物检验（菌落总数、大肠菌群国标法2/平板法、美蓝还原试验）、抗生素检测（嗜热链球菌抑制法/TTC法，乳酸链球菌由实验室提供）、掺假乳实验（掺淀粉、豆浆、碱、盐、甲醛等，可做验证实验）等内容，从实验准备、试剂配制、到完成实验的全过程设计一个详尽合理的实验流程，具体顺序不做要求，但应具体、有可操作性，并在规定的时间内完成上述全部内容，给出实验结果和综合判定。
一、实验目的
了解生鲜乳样的采集和保存方法，掌握乳新鲜度、密度、酸度、微生物含量、抗生素含量、掺假的检验方法。
二、乳样的采集和保存
生鲜牛乳是指从正常饲养的、无传染病和乳房炎的健康母牛乳房内挤出的正常乳。
采样前必须充分搅拌使混合均匀。采用直径10mm镀镍金属管或玻璃管采样，从不同深度采样。采样量若只测脂肪和酸度时50mL即可，若做全面分析取200～300mL，样品应做两个平行。
快速冷却保存： 0～5℃，1～2天； 不做细菌学检验时可加防腐剂保存：每100mL乳加福尔马林1～2滴可保存10～15天；每100mL乳加H2O2 2～3滴，密闭，可保存6～10天。 三、感官检验 1. 检验方法
1.1 色泽：白瓷皿中，检查是否带红色、绿色或明显的黄色； 1.2气味：加热后，嗅其气味； 1.3滋味：品尝；
1.4组织状态：烧杯中，静止1h，小心倒入另一烧杯，看前一烧杯底是否有沉淀和絮状物，再取一滴于大拇指上，检查是否粘滑。 1.5 杂质：是否有豆渣、牛粪、昆虫等杂质。 2. 判定标准 色泽 为乳白色或稍带微黄色 组织状态 呈均匀的流体，无沉淀、凝块和机械杂质，无粘稠和浓厚现象 呈均匀的流体，无凝块，但可见少量微小的颗粒，脂肪聚粘表层呈液化状态 呈稠而不匀的溶液状，有乳凝结成的致密凝块或絮状物 气味 具有乳特有的乳香味，无其他任何异味 滋味 具有鲜乳独具的纯香味，滋味可口而稍甜，无其他任何异常滋味 有微酸味(表明乳已开始酸败)，或有其他轻微的异味 评定结果 良质鲜乳 色泽较良质鲜乳为差，白色中稍带青色 乳中固有的香味稍使或有异味 次质鲜乳 呈浅粉色或显著的黄绿色，或是色泽灰暗 有明显的异味，如酸臭味、牛粪味、有酸味、咸味、苦 金属味、鱼腥味、汽油味等 劣质鲜乳 四、理化分析 1． 相对密度 1.1 原理
使用密度计检测试样，根据读数经查表可得相对密度的结果。
乳的密度是指在20℃时，一定体积的质量与4℃同体积水的质量之比。
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乳的比重是指在15℃时，一定体积的重量与同温同体积水的重量之比。
同温度下：比重 – 密度 = 0.002
乳的密度和比重均可用乳稠计测定，乳稠计有20℃/4℃（密度计）和15℃/15℃（比重计）两种。
本实验中所用为乳密度计。乳密度（ρ420）与乳稠计度数的关系式为： 乳稠计度数=（ρ420读数-1.000）×1000
例：乳密度（ρ420）1.031，则其乳密度度数为31°，比重度数为31° + 2° = 33° 1.2 仪器和设备
密度计：20 ℃/4 ℃；玻璃圆筒或 200 mL～250 mL 量筒：圆筒高度应大于密度计的长度，其直径大小应使在沉入密度计时其周边和圆筒内壁的距离不小于 5 mm。 1.3 分析步骤
取混匀并调节温度为 10 ℃～25 ℃的试样，小心倒入玻璃圆筒内，勿使其产生泡沫并测量试样温度。小心将密度计放入试样中到相当刻度 30°处，然后让其自然浮动，但不能与筒内壁接触。静置 2 min～3 min，眼睛平视生乳液面的高度，读取数值。根据试样的温度和密度计读数查表换算成 20 ℃时的度数。 1.4 测定值校正
若乳温不是20℃时，则乳稠计读数应进行校正。
1）计算法 温度每升高或降低1℃时，乳密度在乳稠计刻度上减小或增加0.0002° 2）查表法
根据牛乳温度和乳稠计读数，查牛乳温度换算见表5-1。将乳稠计读数换算成20℃时的度数。 1.5 判定标准
生鲜乳 特级≥1.030；一级≥1.029；二级1.028； 消毒乳 1.028~1.032
表5-1 牛乳温度换算表
乳稠计度数 25 23.3 23.5 23.6 23.7 23.9 24.0 24.2 24.4 24.6 24.8 25.0 25.2 25.4 25.5 25.8 26.0 26 24.2 24.4 24.5 24.7 24.9 25.0 25.2 25.4 25.6 25.8 26.0 26.2 26.4 26.6 26.8 27.0 27 25.1 25.3 25.4 25.6 25.7 25.9 26.1 26.3 26.5 26.8 27.0 27.2 27.5 27.7 27.9 28.1 28 26.0 26.1 26.3 26.5 26.6 26.8 27.0 27.3 27.5 27.8 28.0 28.2 28.5 28.7 29.0 29.2 29 26.9 27.1 27.3 27.5 27.6 27.8 28.0 28.3 28.5 28.8 29.0 29.2 29.5 29.7 30.0 30.2 30 27.9 28.1 28.3 28.5 28.6 28.8 29.0 29.3 29.5 29.8 30.0 30.2 30.5 30.7 31.0 31.2 31 28.8 29.2 29.2 29.4 29.6 29.8 30.0 30.3 30.5 30.8 31.0 31.2 31.5 31.7 32.0 32.2 32 29.3 30.2 30.2 30.4 30.6 30.7 31.0 31.2 31.5 31.8 32.0 32.3 32.5 32.8 33.0 33.3 33 30.7 31.1 31.1 31.3 31.5 31.7 32.0 32.2 32.5 32.8 33.0 33.3 33.5 33.8 34.1 34.3 34 31.7 31.9 32.1 32.3 32.5 32.7 33.0 33.2 33.5 33.8 34.0 34.3 34.4 34.8 35.1 35.3 35 32.6 32.8 33.1 33.3 33.5 33.7 34.0 34.2 34.5 34.7 35.0 35.3 35.5 35.8 36.1 36.3 36 33.5 33.5 34.0 34.3 34.5 34.7 34.9 35.2 35.6 35.7 36.0 36.2 36.5 36.7 37.0 37.3 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 鲜乳温度（℃） 2． 酒精实验法测酸度
酒精试验法 取1~2 mL 乳于试管中，加入等量的中性酒精（68%或70%或72%的酒精），迅速充分混合，如有絮状物（蛋白沉淀）出现，即为酒精阳性乳，否则为酒精阴性乳。
出现絮状物表示酸度高，乳的酸度与酒精浓度见表5-2
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表5-2 乳的酸度与酒精浓度关系
酒精浓度（%） 68 70 72 出现絮状物的酸度 20 oT 19 oT 18 oT 判定标准
生鲜乳 特级≤18 oT；一级≤19 oT；二级≤20 oT； 消毒乳≤18 oT 2.1 原理
以酚酞为指示液，用0.1000 mol/L氢氧化钠标准溶液滴定100 g试样至终点所消耗的氢氧化钠溶液体积，经计算确定试样的酸度。 2.2 试剂和材料
除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯或以上规格，水为GB/T 6682规定的三级水，中性乙醇—乙醚混合液：取等体积的乙醇、乙醚混合后加3 滴酚酞指示液，以氢氧化钠溶液（4g/L）滴至微红色，氢氧化钠标准溶液（NaOH）：0.1000 mol/L，酚酞指示液：称取0.5 g 酚酞溶于75 mL 体积分数为95 %的乙醇中，并加入20mL水，然后滴加氢氧化钠溶液（8.1）至微粉色，再加入水定容至100 mL。
2.3 仪器和设备
天平：感量为1 mg。15.2 电位滴定仪， 滴定管：分刻度为0.1 mL，水浴锅。 2.4 分析步骤
称取10 g（精确到0.001 g）已混匀的试样，置于 150 mL 锥形瓶中，加 20 mL 新煮沸冷却至室温的水，混匀，用氢氧化钠标准溶液（14.2）电位滴定至pH 8.3 为终点；或于溶解混匀后的试样中加入2.0 mL 酚酞指示液（14.3），混匀后用氢氧化钠标准溶液（14.2）滴定至微红色，并在30 s 内不褪色，记录消耗的氢氧化钠标准滴定溶液毫升数，代入公式（2）中进行计算。 五、微生物检验 1. 菌落总数 1.1 样品的稀释
称取 25 mL 样品置盛有 225 mL无菌水的无菌均质杯内，8000 r/min～10000 r/min 均质 1 min～2 min，制成 1:10 的样品匀液。
1.2 用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1 mL，沿管壁缓慢注于盛有 9 mL 稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用 1 支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成 1:100 的样品匀液。
1.3 按1.2操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用 1 次 1 mL 无菌吸管
或吸头。
1.4 根据对样品污染状况的估计，选择 2 个～3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），
在进行 10 倍递增稀释时，吸取 1 mL 样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取 1 mL 空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。
1.5 及时将 15 mL～20 mL 冷却至 46 ℃的平板计数琼脂培养基（可放置于 46 ℃ ±1℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。 1.6 培养
⑴待琼脂凝固后，将平板翻转，36 ℃ ±1℃培养 48 h±2 h。水产品 30 ℃ ±1℃培养 72 h±3 h。⑵如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约 4 mL），凝固后翻转平板，按⑴条件进行培养。 1.7 菌落计数
可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units，CFU）表示。
⑴选取菌落数在 30 CFU～300 CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于 30 CFU 的
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平板记录具体菌落数，大于 300 CFU 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。
⑵其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。
⑶当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。 2. 大肠菌群国标法2/平板法
大肠菌群平板计数法的检验程序见图如下：
2.1 称取 25 mL 样品,放入盛有225 mL无菌水的无菌均质杯内, 8000 r/min～10000 r/min 均质 1 min～2 min,制成 1:10 的样 品匀液。 2.2 平板计数
⑴选取2个～3个适宜的连续稀释度, 每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1 mL。同时取1 mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。
⑵及时将15 mL～20 mL冷至46 ℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3 mL～4 mL VRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。 2.3 平板菌落数的选择
选取菌落数在 15 CFU～150 CFU 之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为 0.5 mm 或更大。 2.4证实试验
从 VRBA 平板上挑取 10 个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于 BGLB 肉汤管内，36 ℃±1 ℃培养 24 h～48 h，观察产气情况。凡 BGLB 肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。 2.5 大肠菌群平板计数的报告
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食品安全与卫生学实验设计(终定)
