定量多基因荧光原位杂交技术在卵巢癌研究中的应用1
黄宇婷1*，胡林萍2，田菁1，鞠宝辉1，葛菁2，缪为民2，袁卫平2，程涛2，郝权1 *
天津医科大学附属肿瘤医院 妇科肿瘤科1 天津市肿瘤防治重点实验室，天津 300060 中国医学科学院血液病医院（血液学研究所） 实验血液学国家重点实验室2，天津 300020
【摘要】目的：定量多基因荧光原位杂交技术（Quantitative Multi-gene Fluorescent in situ hybridization, QM-FISH）在传统的荧光原位杂交技术基础上联合了最新的基因技术、3D荧光显微镜和数字显像技术，能够同时定量单个肿瘤细胞核的多个基因。该研究首次尝试将QM-FISH技术应用于卵巢癌基因组不稳定性的研究。方法：采用缺口平移法，制作出Spectrum Green: c-myc, PromoFluor-555: Rb1, PromoFluor-590:Chk2, HyPer5:p53, PromoFluor-415:BRCA1五色荧光探针。采集卵巢癌癌腹水标本10例，离心获得腹水细胞经PBS液洗涤后，使用0.075mmol/L的NH4Cl溶液低渗去除红细胞，细胞甩片后用甲醇固定细胞，再用2%甲醛固定细胞，将固定好的细胞进行QM-FISH检测。测量平均荧光信号强度、背景信号强度以及荧光信号分裂率。结果：Spectrum GreenTM、Cy3TM v1（PromoFluor-555）、TexasRedTM
（PromoFluor-590）、Zeiss CY5 CustomTM（HyPer5）、Zeiss PF415TM 滤光片下观察，QM-FISH荧光信号/背景信号比值分别为：12.8±0.2，8.8±0.4，3.8±0.5，5.0±0.4，9.0±0.2。荧光信号分裂率分别为（8.5±1.6）%，（12.4±1.4）%，（15.3±2.6）%，（14.4±2.2）%，（11.9±2.4）%。结论：QM-FISH技术可以成功应用于卵巢癌的研究，是研究卵巢癌基因组不稳定性、确认肿瘤标本特异性等位基因失衡极其有效的工具。
【关键字】 卵巢癌；定量多基因荧光原位杂交；基因组不稳定性
Establishing the Quantitative Multi-gene Fluorescence in situ Hybridization Technique in Ovarian Cancer Research
HUANG Yuting1*, HU Linping2, TIAN Jing1, JU Baohui1, GE Jing2, MIAO Weimin2, YUAN Weiping2, CHENG Tao2，HAO Quan1
*1
Tianjin Oncology Institute and Hospital, Department of Gynecological Oncology, Key Laboratory of Cancer
Prevention and Therapy, Tianjin , China, 300060
2
Institute of Hematology and Blood Disease Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking
Union Medical College, State Key Laboratory of Experimental Hematology, Tianjin, China, 300020 Corresponding Author: HAO Quan, MD., PhD., Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital, Department of Gynecological Oncology, Tianjin, China, 300060 Tel:86-22-23340123. Email: haoquandoctor@126.com
Abstract: Objective: The quantitative multi-gene fluorescence in situ hybridization (QM-FISH) is one of the most advanced technologies for the diagnosis of human cancer and it permits simultaneous quantitation of multiple genes in a single cell, which can be applied in a large scale of clinical investigations. In this study QM-FISH was firstly applied in ovarian cancer research. Methods: Probe DNA (c-myc, Rb1, Chk2, p53 and BRCA1) was labeled with Spectrum Green, 1
基金项目：天津市重大科技支撑计划 新型高分辨多色荧光原位杂交技术在肿瘤研究和诊断中的应用（编号
09ZCZDSF03800）、科技部国际合作项目 单细胞多基因定量分析技术在肿瘤研究和诊断中的应用（编号2010DFB30270）、天津市卫生局基金 基于QM-FISH技术的卵巢癌多基因倍体畸变谱研究（编号2011KZ80）
通讯作者：郝权，天津医科大学附属肿瘤医院妇科肿瘤科，中国天津300060，E-mail: haoquandoctor@126.com
PromoFluor-555, PromoFluor-590, HyPer5 and PromoFluor-415 by nick translation. Prepare 10 samples of ovarian cancer ascite cytospin samples and then performed QM-FISH. The FISH signal was collected and assessed by comparing the relative signal intensity of each fluorophore with the autofluorescence background, ratio of fluorescence signal intensity was calculated. Split signals were also counted. Results: Ratio of fluorescence signal in Spectrum Green, Cy3 v1 (PromoFluor-555), TexasRed (PromoFluor-590), Zeiss CY5 Custom(HyPer5) and PromoFluor-415 channels were 12.8±0.2，8.8±0.4，3.8±0.5，5.0±0.4，9.0±0.2. Split signals counted for （8.5±1.6）%，（12.4±1.4）%，（15.3±2.6）%，（14.4±2.2）%，（11.9±2.4）%. Conclusions: QM-FISH can be successfully applied in the research of ovarian cancer, it is powerful in evaluating genome instability and discovering the allelic imbalance.
【Key Words】Ovarian cancer, Quantitative Multi-gene Fluorescence in situ hybridization, Genome Instability
Supported by the Program of International Science and Technology Cooperation of the Ministry of Science and Technology of the People’s Republic of China (2010DFB30270), Tianjin Technology Support Program of International Science and Technology Cooperation (09ZCZDSF03800) and the Science and Technology Fund of Tianjin Bureau of Public Health (2011KZ80).
随着细胞遗传学与肿瘤病因学研究的不断深入，各种研究显示染色体不稳定性即数值异常(非整倍体)和结构重排(缺失、基因扩增和易位)与肿瘤的形成和发展密切相关。基因诊断技术在当今肿瘤临床医学上的作用不断发展、日益明显[1]。
卵巢癌在妇科恶性肿瘤中发生率居第三，但死亡率高居榜首，五年生存率仅为20-30%。目前各类型肿瘤的诊断都有从细胞学诊断水平向分子诊断水平发展的趋势，仅仅依靠细胞学诊断已经远远不能满足临床工作的需要，分子诊断特别是基因诊断因其在判断肿瘤生物学行为、肿瘤预后、指导治疗和预测化疗敏感性等多方面具有重要作用，已成为肿瘤诊断学的发展趋势。
荧光原位杂交(Fluorescence In Situ Hybridization，FISH)技术是利用碱基的互补性，将标记上荧光素的探针与待测样本的DNA进行杂交，通过荧光显微镜收集荧光信号从而对待测核酸进行定性、定量及定位的方法[2]。各种FISH探针及方法在研究肿瘤细胞的基因组的不稳定性中起重要作用。FISH在研究卵巢癌基因组的不稳定性，以及对恶性肿瘤的诊断、治疗方案选择、治疗反应监测、预后估计中也起着重要作用[3]。定量多基因FISH技术，简称QM-FISH(Quantitative Multi-gene Fluorescence in situ Hybridization)，相较于传统的FISH技术信噪比提高了5-10倍，这正是同时定量分析单个细胞核内多个基因的前提条件。该技术是寻找和确认肿瘤临床标本的特异性等位基因失衡极其有效的工具，可以在同一时间内定量单个肿瘤细胞核的多个基因(目前可同时定量20余个基因)，可以用于大规模研究临床肿瘤标本基因拷贝数的变化(等位基因失衡) [1,4-6]。
该研究首次尝试将QM-FISH技术应用于卵巢癌的研究，建立了使用QM-FISH技术同时检测卵巢癌中多个基因拷贝数变化的实验方法。
1. 材料和方法
1.1 主要试剂和仪器
质粒纯化试剂盒为美国QIAGEN公司产品。EcoR I、ssDNA、tRNA购自美国Sigma公司。质粒DNA（BAC克隆）、DNA Polymerase I、人cot-DNA、SSPE购自美国Invitrogen
公司。Green dUTP为Abbott Molecular公司产品。PromoFluor-555-dUTP、PromoFluor-590-dUTP和PromoFluor-415-dUTP为PromoKine公司产品。HyPer5-dCTP为GE Healthcare公司产品。多色荧光显微镜为Zeiss公司AxioImagerZ2型显微镜连接高分辨率电荷耦合原件（Charge Coupled Device，CCD）相机；DAPI、Spectrum GreenTM和Cy3TM v1滤光片购自Chroma公司，Texas RedTM、Zeiss CY5 CustomTM和Zeiss PF415TM滤光片为Zeiss公司产品。ThermoBriteTM原位杂交仪购自美国自然基因有限公司。离心甩片机为美国Wescor公司产品。 1.2 探针制作
使用UCSC Genome Bioinformatics(http://genome.ucsc.edu/)数据库定位检索BAC（bacterial artificial chromosomes）克隆，各基因使用克隆编码见表1。用Qiagen质粒纯化试剂盒分离提取c-myc、Rb1、Chk2、p53和BRCA1基因的DNA，先用EcroR I酶切DNA，将酶切后的DNA进行沉淀，晾干后溶解于10 mmol/L TrisHCl中。采用缺口平移的方法将荧光染料Spectrum Green、PromoFluor-555、PromoFluor-590、HyPer5和PromoFluor-415分别连接到酶切后的各基因的DNA上，将连接好的DNA进行沉淀，用70%乙醇洗涤1遍，最后溶解到杂交混合液中[5,6]。
表1探针制备及使用BAC克隆RP编码
Table 1 RP numbers of the BACs used in preparing probes
基因 c-myc Rb1 Chk2 P53 BRCA1
荧光染料 Spectrum Green PromoFluor-555 PromoFluor-590 HyPer5
PromoFluor-415
染色体 8q24.21 13q14 22q12.1 17p13.1 17q21.2-q21.31
RP11-944J14 RP11-951P4 RP11-1001I5 RP11-89D11 RP11-242A8 RP11-192B13
RP11-367L7 RP11-305D15 RP11-694G9 RP11-281D3
RP11-948G15
RP克隆编码
RP11-440N18 RP11-102I4 RP11-872I24 RP11-105H15
RP11-831F13
RP11-91B12 RP11-1081A10
1.3 标本来源及处理 1.3.1 标本来源 标本来源于2011年1月至12月间在我院就诊的经病理检查证实为上皮性卵巢癌的患者。采集卵巢癌腹水标本10例。该研究过程获得所有患者的知情同意。 1.3.2 制片过程 取卵巢癌患者腹水标本，离心获得腹水肿瘤细胞。PBS液洗涤后使用
0.075mmol/L的NH4Cl溶液低渗去除红细胞，细胞甩片后用甲醇室温固定过夜，第2天再用2%甲醛固定5min后储存于-20℃的70%乙醇中，使用时在75%、85%、100%梯度乙醇中脱水，晾干后FISH检测备用[7-9]。 1.4 FISH检测
取制备好的FISH检测片加入五色探针，加盖盖玻片，用封片胶封片后85℃变性5min，47℃杂交24hr。47℃核酸杂交缓冲液（saline sodiumphosphate EDTA, SSPE）洗涤5min，55℃SSPE洗涤10min，梯度乙醇中脱水之后放入己烷/异丙醇（60:40）中10min，再放入异丙醇中5min，100%乙醇中5min，在空气中干燥后加入10μl的4,6-二脒基-2-苯基吲哚（4,6- diamidino-2-pheny-lindole, DAPI）复染细胞核，加上Zeiss盖玻片，于荧光显微镜下观察、拍照[1,10]。 1.5 图像采集及FISH信号的判断
使用Zeiss公司AxioImagerZ2型多色荧光显微镜，分别于DAPI、Spectrum GreenTM和Cy3TM v1（PromoFluor-555）、TexasRedTM（PromoFluor-590）、Zeiss CY5 CustomTM（HyPer5）、Zeiss PF415TM 滤光片下观察间期细胞荧光杂交信号，在DAPI图像下选择视野，定位，记录图像采集位置，然后在63倍油镜下同时在DAPI、
TMTMTM
Spectrum Green、Cy3 v1、Texas Red、Zeiss CY5 CustomTM和Zeiss PF415TM6个通路中采集细胞核和5种荧光素的原始图象，软件分析合成最后的分类图象照相记录。用AxioVisionRe 1.4.8软件进行图像分析测量，评估整个片子五色探针杂交情况。每张玻片选择10个区域进行拍照，每个通道分别测量200个以上细胞的平均荧光强度、背景强度和荧光信号分裂率。荧光信号分裂率为：分裂信号细胞数/总细胞数×100%。 1.6 统计学分析
应用SSPS 16.0软件进行统计学分析，实验数据以均数±标准差（X±SD）表示。
2. 结果
2.1 卵巢癌腹水肿瘤细胞QM-FISH检测信号强度 采用AxioVision Re 1.4.8软件进行图像采集、分析和测量。分别测量各个通道中的平均荧光强度及背景强度。Spectrum GreenTM、Cy3TM v1、Texas RedTM、Zeiss CY5 CustomTM和Zeiss PF415TM 5个通道中的平均荧光信号强度分别为：3989.5±21.1，3687.6±16.8，2418.0±79.7，2782.4±41.3，3687.6±25.6。背景信号分别为：312.0±24.9，421.3±32.4，642.2±35.5，560.4±27.9，408.1±11.6（见图2）。荧光信号强度/背景信号强度比值分别为：12.8±0.2，8.8±0.4，3.8±0.5，5.0±0.4，9.0±0.2（见图3）。
图2 卵巢癌QM-FISH在Spectrum Green、Cy3 v1、Texas Red、Zeiss CY5 Custom和Zeiss PF415各通道中荧光信号和背景信号的强度
Figure 2. Signal and background intensity of ovarian cancer samples in the Spectrum Green, Cy3 v1, TexasRed, Zeiss CY5 Custom and Zeiss PF415 channel.
图3 卵巢癌QM-FISH在Spectrum Green、Cy3 v1、TexasRed、Zeiss CY5 Custom和Zeiss PF415各通道中荧光信号/背景信号强度比值
Figure 3. Ratio of signal intensity to background intensity in the Spectrum Green, Cy3 v1, TexasRed, Zeiss CY5 Custom and Zeiss PF415 channel.
2.2 卵巢癌腹水肿瘤细胞QM-FISH观察结果 在Zeiss公司AxioImagerZ2型多色荧光显微镜下，切换DAPI、Spectrum GreenTM、Cy3TM v1、Texas RedTM、Zeiss CY5 CustomTM和Zeiss PF415TM滤光片，观察间期细胞荧光杂交信号。每个滤光片观察一种荧光探针的杂交信号，用高分辨CCD相机拍摄，各通道曝光时间依次为：40ms、1200ms、6000ms、12000ms、25000ms和400ms，在每个拍摄视野中连续立体扫描25层以收集整个细胞核的荧光信号，使用景深扩展功能将25层的荧光信号压缩在1层图片上，最后将6个通道的荧光信号叠加获得QM-FISH检测结果（见图1）。
图1 卵巢癌腹水细胞QM-FISH结果
Figure 1. QM-FISH reports of the of ovarian cancer ascite cytospin samples.
定量多基因荧光原位杂交技术在卵巢癌研究中的应用
