厦大基础创新科研基金申请书

.

SRC-1 基因在许多组织以及细胞中都有表达，通过Northern印迹法，在大脑、骨骼肌、肺、肾、脑垂体、胃、脾、睾丸、心脏、胰腺、肝、下丘脑、肾上腺、和甲状腺上都能够检测到SRC-1 mRNA的表达。SRC-1的蛋白表达也在睾丸、大脑、肺、肝、肾以及心脏检测到。 一些研究表明，SRC-1在19%至29%的乳腺癌中都有显著的上调[7-9]，更重要的是，SRC-1的上调与ERBB2的表达、淋巴结的转移、 DFS呈正相关[7-9]。一项临床研究提出将SRC-1表达水平的上升作为预测治疗后乳腺癌复发的依据[10]。SRC-1对于肿瘤细胞的增殖和转移都起了重要的作用，在MCF-7乳腺癌细胞当中，SRC-1过表达之后，在雌激素的作用下，相关的基因以及细胞的生长都增强了，这说明了SRC-1在雌激素介导的细胞生长方面起了重要的作用[11]。SRC-1敲除之后，小鼠体内乳腺癌向肺转移的程度降低了，同时，在乳腺癌细胞中，E-Cadherin表达量降低了，Twist蛋白表达量升高，都说明了SRC-1在促进乳腺癌的转移方面起了重要的作用[12，13]。 一些研究表明SRC-1的mRNA和蛋白的表达水平与前列腺癌的病变程度呈正相关[14]。在前列腺癌细胞中，SRC-1能够增强雄激素受体介导的细胞增殖，SRC-1敲除之后，能够抑制雄性激素依赖的LNCap 细胞的增殖。在无雄性激素的培养基中，C4-2细胞依赖于雄激素受体生长，而SRC-1敲除之后能够抑制它的生长。然而，SRC-1的减少对于雄激素受体消极的PC-3和DU145前列腺癌细胞的生长没有作用[14]，这些结果表明SRC-1通过增强雄激素受体的功能来促进前列腺癌细胞的生长。 尽管我们发现了SRC-1在多数肝癌中过表达，但是对于SRC-1在肝癌发生发展中的作用及分子机制尚不清楚，本研究课题的主攻关键是揭示SRC-1促进肝癌发生发展的分子机理，这一问题的解决将为肝癌的预后和治疗提供新的思路。 .

.

1. Chen YH, Kim JH, Stallcup MR. GAC63, a GRIP1-dependent nuclear receptor coactivator. Mol Cell Biol 2005;25（14）:5965–72. 2. Kim JH, Li H, Stallcup MR. CoCoA, a nuclear receptor coactivator which acts through an N-terminal activation domain of p160 coactivators. Mol Cell 2003;12（6）:1537–49. 3. Lee YH, Campbell HD, Stallcup MR. Developmentally essential protein flightless I is a nuclear receptor coactivator with actin binding activity. Mol Cell Biol 2004;24（5）:2103–17. 4. Darimont BD, Wagner RL, Apriletti JW, Stallcup MR, Kushner PJ, Baxter JD, Fletterick RJ, Yamamoto KR. Structure and specificity of nuclear-receptor coactivator interactions. Genes Dev 1998;12（21）:3343–56. 5. Heery DM, Kalkhoven E, Hoare S, Parker MG. A signature motif in transcriptional co-activators mediates binding to nuclear receptors. Nature 1997;387（6634）:733–6. 6. Li H，Chen JD，The receptor–associated coactivator3 activates transcription through CREB-binding protein recruitment and autoregulation. J Biol Chem ,1998,273(10);5948-5954 7. Fleming FJ, Hill AD, McDermott EW, O'Higgins NJ, Young LS. Differential recruitment of coregulator proteins steroid receptor coactivator-1 and silencing mediator for retinoid and thyroid receptors to the estrogen receptor-estrogen response element by beta-estradiol and 4- hydroxytamoxifen in human breast cancer. J Clin Endocrinol Metab 2004; 89(1):375–83. 8. Fleming FJ, Myers E, Kelly G, Crotty TB, McDermott EW, O'Higgins NJ, Hill AD, Young LS. Expression of SRC-1, AIB1, and PEA3 in HER2 mediated endocrine resistant breast cancer; a predictive role for SRC-1. J Clin Pathol 2004;57（10）:1069–74. 9. Myers E, Fleming FJ, Crotty TB, Kelly G, McDermott EW, O'higgins NJ, Hill AD, Young LS. Inverse relationship between ER-beta and SRC-1 predicts outcome in endocrine-resistant breast cancer. Br J Cancer 2004; 91(9):1687–93. 10. Redmond AM, Bane FT, Stafford AT, McIlroy M, Dillon MF, Crotty TB, Hill AD, Young LS. Coassociation of Estrogen Receptor and p160 Proteins Predicts Resistance to Endocrine Treatment; SRC-1 is an Independent Predictor of Breast Cancer Recurrence. Clin Cancer Res 2009; 15(6):2098–2106. 11. Tai H, Kubota N, Kato S. Involvement of nuclear receptor coactivator SRC-1 in estrogen- dependent cell growth of MCF-7 cells. Biochem Biophys Res Commun 2000; 267(1):311–6. .

.

12. Wang S, Yuan Y, Liao L, Kuang SQ, Tien JC, O'Malley BW, Xu J. Disruption of the SRC-1 gene in mice suppresses breast cancer metastasis without affecting primary tumor formation. Proc Natl Acad Sci U S A 2009; 106(1):151–6. 13. Qin L, Liu Z, Chen H, Xu J. The steroid receptor coactivator-1 (SRC-1) regulates Twist expression and promotes breast cancer metastasis. Cancer Res 2009; 69(9):3819–3827. 14. Agoulnik IU, Vaid A, Bingman WE 3rd, Erdeme H, Frolov A, Smith CL, Ayala G, Ittmann MM, Weigel NL. Role of SRC-1 in the promotion of prostate cancer cell growth and tumor progression. Cancer Res 2005; 65(17):7959–67. 2、 项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键科学问题。（此部分为重点阐述内容） 2-1.人肝癌组织样品分析 本课题组已搜集50例肝癌病人的肝癌组织和相应的癌旁组织标本以及它们的临床数据，我们将使用Western Blot 及 Real-Time 等手段对这些肝癌样品进行研究分析，重点检测SRC-1在肝癌组织和癌旁组织样品中的表达情况，以及P21、PCNA、MMP-9等与细胞增殖、迁移等有关的基因的表达情况，以确定在组织样品中SRC-1对细胞增殖、迁移等能力的影响。并结合病人的临床数据进行综合的分析，以研究SRC-1在肝癌发生和发展中的作用。 2-2.SRC-1基因沉默细胞株的筛选 为了研究SRC-1基因沉默之后对肝癌细胞表型的影响，我们拟在各个肝癌细胞株中筛选SRC-1基因沉默的细胞株。在各个肝癌细胞株中，用脂质体转入质粒pSuper-shSRC-1，之后用嘌呤霉素进行筛选。通过比较这些细胞株与对应的对照细胞株的增殖、迁移和成瘤能力的差异，以揭示SRC-1的敲除对肝癌细胞增殖、侵袭和成瘤.

.

的影响。 2-3. SRC-1下调对肝癌细胞增殖影响的研究。 我们拟用细胞增殖实验（MTT法）和克隆形成实验等手段检测各个肝癌细胞株与对应的SRC-1基因沉默的细胞株的生长，用流式细胞技术检测这些细胞株的细胞周期进程，以验证SRC-1是否通过促进细胞周期进程来促进细胞生长。 2-4. SRC-1下调对肝癌细胞迁移和侵袭影响的研究。 癌细胞的迁移和侵袭在肿瘤发生发展中起着重要的作用，为了研究SRC-1是否对肝癌细胞的迁移和侵袭产生影响，我们拟利用铺有Matrigel的Transwell侵袭实验来检测这些SRC-1基因沉默细胞株和对应的对照细胞的侵袭能力。 2-5. SRC-1下调对肝癌细胞成瘤影响的研究 我们拟利用筛选得到的细胞株进行肝癌细胞的裸鼠皮下成瘤实验，以验证SRC-1是否会促进肝癌细胞的成瘤能力。 2-6. 原发性肝癌模型的建立。 我们拟以SRC-1基因敲除的小鼠和野生型的小鼠为实验对象，建立DEN诱导的原发性肝癌模型和DEN/TCP诱导的原发性肝癌模型。之后对小鼠肝肿瘤的一系列生理生化指标进行检测分析，包括肿瘤的数量、重量、直径、体积等，最终确定SRC-1对于肝癌发生发展的影响。 .

.

3、拟采取的研究方案及可行性分析。（包括有关方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明） 3-1.主要实验方法 (1) Western blot 测定蛋白表达水平：按常规制备细胞裂解液，在 SDS-PAGE 胶上电泳，蛋白转膜后与相应抗体孵育，ECL 试剂盒显示蛋白。 (2) 萤光酶（Luciferase）活性测定：将带有 Luciferase 报告基因的质粒转染入肝癌癌细胞中，24 h 后收集并裂解细胞。然后将装有细胞裂解液的小管置于荧光光子测定仪中，并加入荧光素酶－荧光素反应液，即刻测定反应液加样品后10 秒内释放的光子量，以此表示荧光酶活性。 (3) 实时荧光定量 PCR测定基因转录水平：提取细胞总RNA，以此为模板，oligo dT为引物，反转录出 cDNA。根据特定基因用相应的引物和探针，以 cDNA 为模板在荧光 PCR 仪上进行 PCR。然后对实时 PCR 的曲线进行分析，通过比较其与标准品 Ct 值的差别，确定基因的转录水平。 (4) 细胞增殖实验（MTT 法） ：将适宜浓度的 100ul 细胞悬液接入 96 孔板中。细胞贴壁后，加入 MTT。37℃，5% CO2 细胞培养箱孵育 4 小时后加入裂解液裂解过夜。第二天取样检测 OD560 吸光值。 (5) 流式细胞仪检测细胞周期：将 1×106细胞接种于 60 mm 培养板，细胞过夜培养.