自噬性降解小窝蛋白1在肝窦内皮细胞去窗孔化中的作用及机制研究

自噬性降解小窝蛋白1在肝窦内皮细胞去窗孔化中的作用及机

制研究

研究背景及目的近年来,随着对肝内多种细胞的深入研究,肝窦内皮细胞(liversinusoidal endothelial cells,LSECs)及其去窗孔化(defenstration)过程,在肝损伤中的重要促纤维化作用逐渐被揭开,寻找维持LSECs窗孔化的机制及靶点也成为了目前的研究热点。一系列实验表明,自噬作为细胞内重要的能量调节过程,与肝内多种细胞的生理、病理过程均有密切联系。

实验证明,自噬既与细胞骨架蛋白及经典的窗孔维持途径——一氧化氮依赖通路(NO-dependentpathway)有着密切的联系,也可以调节内皮细胞的表型和功能。而LSECs上的结构蛋白——小窝蛋白1(caveolin-l,CAV-1)不仅可以调节肌动蛋白丝(actin filament,F-actin)的运动从而影响LSECs窗孔的收缩,还与自噬之间有着复杂的相互作用。

因此,探究自噬能否降解cav-1参与LSECs去窗孔化过程及其涉及的关键信号通路及蛋白,对于我们进一步了解肝纤维化的发病机制及找到治疗靶点有重要的意义。研究方法我们从临床收集人类肝纤维化标本并使用S-D大鼠构建四氯化碳(CCL4)诱导肝纤维化模型。

体外实验中,我们利用si-RNA(si-cav1)及腺病毒转染过表达cav-1基因来上调和下调LSECs内的cav-1蛋白的表达,并使用自噬抑制剂3MA及自噬诱导剂雷帕霉素从正反两方面验证自噬对LSECs去窗孔化的影响;探索在血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)刺激下,自噬、cav-1与LSECs去窗孔化之间的关系及其涉及的关键信号通路。结果体内实验中,我们发现人类纤维化肝脏中自噬水平升高而cav-1表达减少。

在CCL4诱导大鼠纤维化模型中,LSECs去窗孔化的发生伴随着自噬的增加,cav-1的降解以及F-actin的重构;而同时注射3MA可以维持窗孔化并减轻肝纤维化程度。体外实验中,分离原代LSECs体外培养,可观察到窗孔快速消失并伴随NO依赖通路、PI3K-AKT-MTOR通路的下调以及cav-1的降解。

VEGF刺激可以激活PI3K-AKT-MTOR通路,抑制cav-1的降解,减少F-actin的重构及激活NO依赖通路从而维持窗孔。自噬抑制剂3MA及巴弗洛霉素可以抑制自噬和cav-1的降解,激活NO依赖通路并维持窗孔;相反的,L-NAME及si-eNOS抑制eNOS可以促进自噬从而加速去窗孔化过程。

而且,过表达cav-1抑制雷帕霉素诱导的自噬性降解cav-1并维持窗孔,而敲除cav-1则激活AMPK/ULK通路并促进窗孔消失。结论自噬性降解cav-1可以抑制NO依赖通路,促进F-actin重构,导致LSECs去窗孔化,PI3K-AKT-MTOR通路及MAPK/ULK通路也参与了这一过程。