冬虫夏草虫草菌丝体及蛹虫草中核苷类成分的测定

冬虫夏草、虫草菌丝体及蛹虫草中核苷类成分的测定 梅雪艳1*，李媛媛2，沈于兰1（1 江苏省无锡药品检验所，无锡 214028；2 江南大学，

无锡 214122）

摘要 目的：核苷类成分为冬虫夏草及其代用品中的有效成分。本文建立高效液相色谱法定量测定冬虫夏草、虫草菌丝体及蛹虫草中的腺嘌呤、腺苷、虫草素的含量，可为冬虫夏草及其代用品的质量研究及开发利用提供科学依据。方法：采用资生堂 MG Ⅱ

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C18(4.6*250mm,5μm)色谱柱，以乙腈－水梯度洗脱，检测波长为260 nm，流速1.0 mL·min，

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外标法定量测定。结果：腺嘌呤、腺苷、虫草素分别在0.001239~0.3098 mg·mL(腺嘌呤)，

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0.001241~0.3102 mg·mL(腺苷)，0.000813~0.2032 mg·mL(虫草素)范围内与峰面积呈良好的线性关系（r＝0.9999）；平均回收率（n＝9）为97.9%（腺嘌呤），97.0%（腺苷），95.8%（虫草素）。结论：本法简便准确，灵敏度高，通用性好，适用于冬虫夏草及其代用品中腺嘌呤、腺苷、虫草素的定量测定。

关键词 冬虫夏草；腺嘌呤；腺苷；虫草素；高效液相色谱法；含量测定

Simultaneous Determination of Adenine、Adenosine and Cordycepin in Cordyceps sinensis and Its Substitutes

MEI Xue-yan1*, LI Yuan-yuan2, SHEN Yu-lan1 (1 Wuxi Institute for Drug Control of Jiangsu Province, Wuxi 214028；2 Jiangnan University, Wuxi 214122)

Abstract Objective:To establish a HPLC method for simultaneous determination of adenine、adenosine and Cordycepin in Cordyceps sinensis and its similar products. Method:A SHISEIDO MG Ⅱ C18(4.6*250 mm,5 μm) was used as the analytical column and mobile phase was acetonitrile –water with gradient elution at a flow rate of 1.0 mL·min-1.The UV detection wavelength was set at 260 nm. Results:The linear calibration curve was obtained in the concentration range of 0.001239~0.3098 mg·mL-1(adenine),0.001241~0.3102 mg·mL-1 (adenosine),0.000813~0.2032 mg·mL-1（cordycepin）（r=0.9999）;The average recoveries (n=9) of adenine 、adenosine and cordycepin were 97.9%、97.0% and 95.8%. Conclusion:The method is simple, rapid and reliable for the determination of adenine、adenosine and cordycepin in Cordyceps sinensis and its similar products.

Key words: Cordyceps sinensi; Adenine; Adenosine; Cordycepin; HPLC; Content determination

冬虫夏草为麦角菌科真菌冬虫夏草 Cordyceps sinensis (Berk . ) Sacc . 寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体[1]，具有补益功效，具有免疫调节、抗肿瘤、降血

[作者简介] 梅雪艳，女，高级工程师，主要从事药品监管及药物分析研究。联系电话：18921129256，E_mail：mxy6036@163.com

糖、抗氧化等多种药理作用。天然冬虫夏草主要寄生于我国青藏高原海拔3000～5000ｍ的高寒地带，生长条件苛刻，自然寄生率低，导致其本身资源非常有限。因此，人们开始探求冬虫夏草的替代品以满足市场需求。冬虫夏草的替代品目前主要有两种，一种是利用从冬

[4]

虫夏草中分离的不同菌种经深层发酵培养而成的虫草菌丝体；一种为半人工培养，将虫草菌接种于蚕蛹等虫体后，在适宜的环境条件下，使其长出同野生冬虫夏草形态近似的子实体[5][6]

。核苷类成分为冬虫夏草及其代用品中的主要成分，有抗肿瘤、调节机体免疫力等药理[7-8]

活性。

[3,7,8]

文献报道测定冬虫夏草中核苷类成分的方法主要有高效液相色谱法、毛细管电泳法[9][10]

和液质联用法，现有文献中多只选择核苷类成分中的1-2个（多为腺苷和虫草素）作为质控指标进行评估，或只选择冬虫夏草及其替代品中的1-2种作为检测对象。本文建立了HPLC法测定冬虫夏草及其替代品中核苷类成分的含量，采用简单的梯度洗脱系统同时分离并定量腺苷，腺嘌呤，虫草素三个成分（腺嘌呤为核苷类成分的重要组成，且其在冬虫夏草及其替代品中含量差异较大，可作为区分依据，故本文增加了测定了腺嘌呤这一成分），该方法通用性好，简便准确，分离时间快于文献报道的方法。同时本文选择了天然冬虫夏草、虫草菌丝体及蛹虫草作为检测对象，并对检测结果进行了系统的分析，可为冬虫夏草及其代用品的质量研究及开发利用提供科学依据。 1 仪器与试药

梅特勒电子天平 AG-285 、XP-6电子天平， Agilent 1200液相色谱仪系统。

腺苷、腺嘌呤、虫草素对照品购自中国食品药品检定研究院，批号110879-200202、110886-201102、110858-200202；冬虫夏草购自中国食品药品检定研究院（批号121201-201103），虫草菌丝体胶囊购自药品批发企业（均为国药准字号中成药，厂家A批号：LF12004，厂家B批号：121147，厂家C批号：121146），蛹虫草由江苏省蚕桑研究所提供（由江苏省蚕桑研究所鉴定）。乙腈为色谱醇，水为二次纯化水，其它试剂均为分析纯。 2 方法与结果 2.1 色谱条件

色谱柱为资生堂 MG Ⅱ C18(4.6*250 mm,5 μm)，以乙腈－水为流动相梯度洗脱，检测

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波长为260 nm，流速1.0 mL·min，进样量为10 μL，柱温：35 ℃。洗脱程序见表1。 表1 流动相梯度洗脱程序

Tab 1 The mobile phase gradient program 时间/min 0-10 10.1-19 19.1-29 29.1-35

水/% 100 97 92 100

乙腈/% 0 3 8 0

[2-3]

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液制备：

精密称取腺苷、腺嘌呤、虫草素对照品各5 mg于10 mL量瓶中，加20％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。以20％甲醇稀释成各种浓度的混合对照品溶液。 2.2.2 供试品溶液的制备：

取样品粉末（过二号筛）0.5 g，精密称定，置10 mL量瓶中，加20%甲醇约8 mL，超声处理30 min，取出，加20%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 专属性实验

在上述色谱条件下，腺嘌呤、腺苷、虫草素峰形良好，保留时间分别为16.9、24.6、25.8 min（图1），分离度均大于1.5，样品中杂质不干扰样品测定。

A

B

C

D

图1 A 腺苷、腺嘌呤、虫草素对照品溶液色谱图 B 冬虫夏草正品供试品溶液色谱图

C 蛹虫草供试品溶液色谱图 D 人工虫草菌丝体供试品溶液色谱图 Fig 1 A Chromatograms of adenine、adenosine and cordycepin reference substance B Chromatograms of cordyceps sinensis

C Chromatograms of cordyceps militaris

D Chromatograms of cultured Cordyceps mycelia 2.4 标准曲线及线性范围

精密量取腺苷、腺嘌呤、虫草素对照品储备液，用20％甲醇经适当比例稀释，分别配成

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310.2、155.1、31.02、6.204、1.241 μg·mL(腺苷)， 309.8、154.9、30.98、6.196、

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1.239 μg·mL(腺嘌呤)， 203.2、101.6、20.32、4.064、0.8130 μg·mL(虫草素)的对照品溶液。按“2.1”项下色谱条件进行分离测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为A＝32678.32c+11.90，r＝0.9999（腺苷）；A＝56730.43c+13.47，r＝0.9999（腺嘌呤）；A＝34496.00c-9.42，r＝0.9999（虫草素）。腺苷、腺嘌呤、虫草素在上述浓度范围内线性关系均良好。 2.5 精密度实验

精密吸取腺苷、腺嘌呤、虫草素对照品混合溶液，按照“2.1”项下色谱条件连续进样5次，每次10 μL，测定峰面积，结果腺苷RSD为0.3%，腺嘌呤RSD为0.9%，虫草素RSD为0.4%。 2.6 重复性实验

取同一份的样品5份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，依法测定，实验结果分别为

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腺苷的含量分别为1.20,1.19.1.22,1.18,1.20 mg·g,RSD为1.3％；腺嘌呤的含量分别为

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0.090,0.091,0.088,0.090,0.089 mg·g, RSD为1.3％；虫草素的含量分别

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1.95,1.93,1.96,1.94,1.92 mg·g, RSD为0.9％。 2.7 稳定性实验

取供试品溶液，室温放置，分别在0，2，4，6，8 h进样，依法测定，记录峰面积，结果5次进样测定腺苷峰面积RSD为0.4%，腺嘌呤峰RSD面积为0.6%，虫草素峰面积RSD为0.8%，结果表明，供试品溶液在8 h内较稳定。 2.8 加样回收率实验

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取同一批蛹虫草样品（腺嘌呤含量0.093 mg· g，腺苷1.126 mg· g，虫草素1.754

mg· g）9份,每份0.25 g，精密称定，3份为一组，分别精密加入腺嘌呤浓度为0.02519

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mg· mL，腺苷浓度为0.3002 mg· mL，虫草素浓度为0.4521 mg· mL的混合对照品溶液0.5 mL,1 mL,2 mL。按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件测定，计算加样回收率。腺嘌呤高、中、低三个浓度的加样回收率分别为98.41%、97.62%、97.02%；腺苷高、中、低三个浓度的加样回收率分别为97.53%、97.07%、96.24%；虫草素高、中、低三个浓度的加样回收率分别为96.86%、95.33%、95.10%。 2.9 样品测定

取天然冬虫夏草及其代用品样品各2份，分别按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，按照“2.1”项下色谱条件测定腺嘌呤、腺苷、虫草素的色谱峰面积，以外标法计算腺嘌呤、腺苷、虫草素的含量，结果见表3。

表2 腺嘌呤、腺苷、虫草素的含量测定 Tab 2 Determination results of samples 名称

天然冬虫夏草 蛹虫草A 蛹虫草B 蛹虫草C

虫草菌丝体胶囊（厂家A） 虫草菌丝体胶囊（厂家B） 虫草菌丝体胶囊（厂家C）

虫草菌丝体胶囊（厂家A） 虫草菌丝体胶囊（厂家B） 虫草菌丝体胶囊（厂家C）

腺嘌呤/mg?g-1 0.26

0.09 0.11 0.09 1.66 0.76 1.17

腺嘌呤/mg?粒-1 0.415 0.380 0.386

腺苷/ mg?g-1 0.49 1.20 0.65 1.13 3.29 1.85 2.56

腺苷/mg?粒-1 0.822 0.925 0.845

虫草素/ mg?g-1 / 1.95 1.50 1.75 / / /

每粒装量/g 0.25 0.50 0.33

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3 讨论

3.1 实验中选择甲醇－水，乙腈－水进行等度、梯度洗脱，结果表明当使用乙腈－水系统

进行梯度洗脱时，腺嘌呤、腺苷、虫草素峰型良好，三个主峰以及供试品中主峰与杂质峰能得到基线分离，故选用乙腈－水系统进行梯度洗脱。梯度程序0-10min使用100%水洗脱供试品中极性较大的杂质干扰，10.1-19min使用3%的乙腈洗脱腺嘌呤成分，19.1-29min使用8%的乙腈洗脱腺苷及虫草素。

3.2 核苷易溶于醇和水，分别选择用水，20%甲醇，50%甲醇，甲醇进行提取，结果表明当

使用20%甲醇时，杂质干扰小且回收率较高，故选用20%甲醇作为提取溶剂。

提取时间，考察了超声10 min，30 min，1 h，结果表明超声30 min可将腺苷、腺嘌呤、虫草素这三种成分提取完全。

3.3 从表3可以看出天然冬虫夏草、虫草菌丝体和蛹虫草中，腺嘌呤的含量为虫草菌丝体最

高，天然冬虫夏草次之，蛹虫草最低；腺苷的含量为虫草菌丝体最高，蛹虫草次之，天然冬虫夏草最低；而虫草素只在蛹虫草中被测出，天然冬虫夏草和虫草菌丝体中均未测得。可见天然的冬虫夏草和蛹虫草、虫草人工菌丝体在核苷类成分构成比例上存在差异，而虫草素为蛹虫草中较特有的成分。

虫草菌丝体胶囊（厂家A）为麦角菌科真菌虫草头孢(Cephalospovium sinens is Chen.sp.nov)经液体深层发酵所得菌丝体的干燥粉末制成的胶囊；虫草菌丝体胶囊（厂家B）为发酵冬虫夏草菌粉[Cs-C-Q80 中华被毛孢 Hirsutella sinensis Liu,Guo,Yu-et Zeng(1989)经液体深层发酵所得菌丝体的干燥粉末]制成的胶囊；虫草菌丝体胶囊（厂