酶工程设计方案

木瓜蛋白酶的研究

木瓜蛋白酶（Papain），又称木瓜酶，是一种蛋白水解酶。木瓜蛋白酶是番木瓜中含有的一种低特异性蛋白水解酶，广泛地存在于番木瓜的根、茎、叶和果实内，其中在未成熟的乳汁中含量最丰富。木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸，属于巯基蛋白酶，它具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等特点，因此在食品、医药、饲料、日化、皮革及纺织等行业得到广泛应用。

1.研究背景

1.1 酶的来源

木瓜蛋白酶是番木瓜中含有的一种低特异性蛋白水解酶，广泛地存在于番木瓜的根、茎、叶和果实内，其中在未成熟的乳汁中含量最丰富。在中国，木瓜种植主要分布在广西的横县和邕宁县等地，属于广西特产水果，因此，木瓜蛋白酶生产厂家主要集中在广西南宁市。

1.2 酶的结构

木瓜蛋白酶是一种蛋白水解酶，分子量为23406，由一种单肽链组成，含有212个氨基酸残基。至少有三个氨基酸残基存在于酶的活性中心部位，他们分别是Cys25、His159和Asp158，当Cys25被氧化剂氧化或与金属离子结合时，酶的活力被抑制，而还原剂半胱氨酸（或亚硫酸盐）或EDTA能恢复酶的活力，另外六个半胱氨酸残基形成了三对二硫键,且都不在活性部位。纯木瓜蛋白酶制品可

含有：（1）木瓜蛋白酶，分子量21000，约占可溶性蛋白质的10%；（2）木瓜凝乳蛋白酶，分子量26000，约占可溶性蛋白质的45%；（3）溶菌酶，分子量25000，约占可溶性蛋白质的20%及纤维素酶等不同的酶。

1.3 酶的性质

木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。它的外观为白色至浅黄色的粉末，微有吸湿性；木瓜蛋白酶溶于水和甘油，水溶液为无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。木瓜蛋白酶是一种含巯基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，但几乎不能分解蛋白胨。木瓜蛋白酶的最适合PH值6～7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点为8.75；木瓜蛋白酶的最适合温度55～65℃，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。

1.4 酶的用途

木瓜蛋白酶在食品工业上主要用于啤酒抗寒、肉类软化、谷类预煮的准备、水解蛋白质和肉类香料的生产；在工业上主要用于明胶制造、蚕茧脱胶、皮革脱毛等；在医药卫生方面，主要用于治疗消化不良、各种炎症和水肿，防止腹膜粘连，处理血检及创伤脱痂以及作为驱肠虫剂等；此外，它还可以用于研究蛋白质结构。在啤酒抗寒和肉类软化方面的应用远比其他蛋白酶类广泛。 1.4.1啤酒澄清剂

引起啤酒冷藏混浊时主要原因是啤酒中的蛋白质极易与多元酚结合成大分子

的复合物。利用啤酒澄清剂中的木瓜蛋白酶对形成混浊的蛋白质有广泛的特异性，能把大分子的蛋白质降解成小分子的物质，提高了蛋白质与多元酚复合物的溶解度；另一方面，木瓜蛋白酶是一种具有生物活性的蛋白质，该蛋白质可与引起啤酒冷藏混浊的多元酚形成稳定状态平衡，防止了啤酒的冷藏混浊。 1.4.2肉类嫩化剂

利用木瓜蛋白酶能裂解肉类中的胶原蛋白和肌肉纤维，而使肉的结构松散。由于木瓜蛋白酶是半胱氨酰基蛋白酶，能降解胶原纤维和结缔组织蛋白质，它将肌动球蛋白和胶原蛋白降解成为小分子的多肽甚至氨基酸, 令肌肉肌丝和筋腰丝断裂, 使肉类变得嫩滑，并简化蛋白质结构使人体食用后易于消化吸收。 1.4.3 饼干松花剂

利用木瓜蛋白酶的酶促反应, 将面团的蛋白质降解为小分子的肤或氨基酶, 降低了面团的拉伸阻力, 使面团变得柔软、更有可塑性, 减少弹性, 易于成型。用量视饼干厂的加工方法和面团中蛋白质的含量不同而不同，研究表明每公斤面添加0.6-1.0万单位/ 克为佳。

1.4.4 科研应用

木瓜蛋白酶可用于细胞培养实验，在准备细胞培养液的第一步中被用于分离细胞。用酶处理小组织块10分钟后，就可以将连接细胞的细胞外基质打断；然后再用蛋白酶抑制剂来停止反应，防止木瓜蛋白酶进一步裂解细胞本身；最后用pasteurpipette将组织块打散为单细胞悬浮液；在免疫学中，木瓜蛋白酶可被用于将免疫球蛋白的F c片段（可结晶）和Fab片段（抗原结合）切割开。

1.5 酶的研究现状

木瓜蛋白酶的生产和研究有将近20年的时间。近年来我们在研究木瓜蛋白酶的基础上，用纤维素及琼脂作载体，成功地制备了纤维素固定化木瓜蛋白酶及琼脂固定化木瓜蛋白酶，并测定了其营养价值及对啤酒的防浊能力。1980—2006年木瓜酶专业总文献量195篇。以分析测定为主题的论文最多，共有55篇，其次是分解降解有42篇；药理研究中又以消炎止痛的文献为多；生产工艺中以研究木瓜酶的生产居多；食理研究主要应用于肉嫩化。木瓜酶文献以分析测定最多，反映出分析鉴定在木瓜酶研究中占据着重要地位。

2.研究内容

木瓜蛋白酶作为水解蛋白酶属于半胱氨酸蛋白酶家族，主要存在于番木瓜的乳汁中，其应用广泛，包括细胞分离、化妆品、洗涤剂、食品和医药等行业，由于受到环境和其他条件的影响，容易变性失活，降低催化效率，从而限制了其大规模的应用。

2.1 木瓜蛋白酶的固定化及活性测定

固定化酶是近代生物技术的重要手段，利用不同载体制备固定化木瓜蛋白酶，可以大大节约用酶，并能反复利用。目前国外已开始在酿造、牛奶加工等多种领域中广泛应用。 2.1.1 固定化酶的研究

固定化酶的研究最早可以追溯到1916年Nelson和Griffin首先发现被骨碳粉末吸附的酵母蔗糖酶仍具有催化活性。接着在1953年Grubhofer和Schleith

开始进行了以应用为目的的固定化酶的研究工作，他们将羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合在修饰过的聚苯乙烯树脂上，实现了酶的固定化。进入六十年代后，固定化酶的研究得到了迅速发展，科研工作者们开发出了许多新的酶固定化方法，并对固定化酶的理化性质进行了大量的研究我国的固定化酶研究开始于1970年，首先是微生物所和上海生化所的酶学工作者同时开始了固定化酶的研究工作。此后，许多单位相继进行了固定化酶的应用研究。 2.1.2 固定化酶与游离酶活性测定

在锥形瓶中加入一定量的原始载体，再加入木瓜蛋白酶液及DAS溶液(或戊二醛溶液)，25℃下交联反应一段时间，过滤，用大量蒸馏水洗涤，再用Tris—HCI缓冲液洗涤，得到固定化酶，待测固定化酶活性。固定化酶活性测定：在锥形瓶中加入适量的固定化酶(m1)，3ml酶激活剂，37℃水浴中预热10min后，加入10ml酪蛋白溶液(已经于37℃水浴中预热，摇匀，在37℃水浴中精确反应10min，然后加入10ml三氯醋酸溶液，剧烈摇动后，在37 ℃水浴中放置0.5h，过滤或离心，同前测吸光值。对照空白：在加入底物之前加入三氯醋酸终止剂，其余步骤同上；游离酶活性测定：在锥形瓶中依次加入1ml酶液(VI)、3ml酶激活剂，37℃水浴中预热10min后，加入10ml酪蛋白溶液(已经于37℃水浴中预热)，摇匀，在37℃水浴中精确反应10min，然后加入10ml三氯醋酸溶液，剧烈摇动后，在37℃水浴中放置0.5h后，过滤或离心，测滤液或上清液在275nm处的吸光值。对照空白：在加入底物之前加入三氯醋酸终止剂，其余步骤同上。 2.1.3 固定化酶的特性 2.1.3.1储存半衰期

游离酶在室温下储存1．5d后，其活力只有原始酶活力的一半不到，而凝胶型或大孔型PS微球所制备的柔性固定化酶在室温下储存8天后，仍保留有原固定化酶活力的80％以上，根据酶活力半衰期公式计算，可知其半衰期为26～329S：。由此可见，柔性固定化酶的储存稳定性远远高于游离酶。 2.1.3.2 热稳定性

将柔性固定化酶及游离酶在70\下育温1小时之后冷却至4'C，再在37\下测酶活力，结果发现PS—NH2载体制备的柔性固定化酶经育温后仍有原活力的90％，而游离酶在此温度下育温后，活力损失了60％以上，因此柔性固定化酶具有较好的热稳定性。 2.1.3.3 有机试剂的影响

将0.1g柔性固定化酶加入至5m150％的有机试剂中，存放0．5h后再测定其活力，经有机试剂浸泡后，柔性固定化酶的活力仍保留有原始活力的50％以上。而游离酶同样经有机试剂浸泡后其活力保留不到20％，可见柔性固定化酶对有机试剂的稳定性好于游离酶。

2.2 木瓜蛋白酶的超声波提取法

目前，木瓜蛋白酶的提取、提纯方法很多，大多需经过各种分级沉淀、盐析、结晶、洗涤、层析等过程，这些方法提取成本高，产量低，操作较繁琐；而且经割采乳汁后的番木瓜果实未能得到充分的利用，从而造成浪费．利用超声波提取番木瓜果浆中的木瓜蛋白酶，可以提高酶的提取率，从而提高原料利用率和产品产量。

2.2.1 酶液制备

选择新鲜的番木瓜，清洗去皮、籽、瓤后，切块破碎，称取果肉，加入一定

量的4℃蒸馏水进行打浆；果浆在一定条件下进行超声波(采用不同功率、不同时间进行对照)处理，4000 r/min离心15 min；除杂过滤后，上清液选用截留分子质量为20000 u的PP中空纤维膜进行超滤浓缩，收集酶液样品，冰箱保存备用。为保持样品的活性，超声波处理前先预冷至O一4℃，超声波处理时采用冰浴冷却，整个过程中料液的温度尽量控制在低温状态，重复3次。 2.2.2 蛋白质含量、木瓜蛋白酶活力的测定

蛋白质含量的测定采用Folin一酚法o7I，标准曲线的回归方程为： y=1570.089x一65.181(r=0.964，n=9).式中：y表示蛋白质质量浓度／(ug/ml)；x表示D(500 nm)．

1ml酶液在一定温度和pH条件下，1 min水解酪蛋白产生lug的酪氨酸为1个酶活力单位(U)。该酶水解酪蛋白底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，将未水解的酪蛋白沉淀除去，滤液用紫外分光光度法测定，可根据光密度计算酶活力。 标准曲线回归方程为：y=127.305x一2.010(r=0.996，n=5).式中：y表示酪氨酸质量浓度／(ug/ml)；x表示D(275 nm)．

样品酶活力的测定：取适当稀释的酶液2．00 ml在(40±O．2)℃下预热2 min，加入2．00 ml已在(40士0．2)℃恒温水浴中预热5 min的酪蛋白溶液(10 mg/ml)，摇匀；加入时开始计时，反应10min后，加入4．00 ml三氯乙酸，立即摇匀，终止反应；从水浴中取出，静置10 min后过滤；在275 nm波长下，用10 mm比色皿，测定滤液的D(275 nm)．酶试样做3个平行试样；空白对照试验，先加入三氯乙酸，然后加酪蛋白溶液．重复3次．

酶活力的计算：

X=A×K×8／2×l／10×n×E=2／5×A×K×n×E

式中：x表示样品酶活力／U；A表示试样溶液的D(275 nm)；K表示吸光常数；n表示稀释倍数；E表示换算系数(0.50)．

木瓜蛋白酶比活力／(U/g)=酶活力／蛋白质含量 2.2.3 结论

在研究超声波提取木瓜蛋白酶的工艺中，发现超声波可以有效提高酶的提取率。超声波产生的空化效应，一方面赋予溶剂对细胞壁更大的渗透力，并强化细胞内外的质量传输，另一方面破坏细胞壁，使细胞内含物更易释放，从而强化了提取过程。结果表明：超声波作用功率不宜太大，作用时间不宜太长，容器周围以冰浴冷却处理，尽量减小超声空化局部过热引起的酶活性丧失；通过单因素及正交试验，得到最佳提取工艺为：超声功率300 w，超声时问200s，这时酶活力是未经超声波处理的1.71倍。

2.3 双金属Hg2+和Cu2+对木瓜蛋白酶活性与构象的影响

利用FT-IR、荧光发射以及紫外吸收光谱探讨Hg2+和Cu2+处理与木瓜蛋白酶二级结构变化的关系。研究结果表明：金属离子与木瓜蛋白酶活性之间存在剂量一效应关系，表现出低剂量促进，高剂量抑制的现象。 2.3.1 实验方法

分别精确称取HgCl2和CuCl2适量，用Tfis—HCl缓冲液配成一定浓度的HgCl2和CuCl2溶液。精确称取木瓜蛋白酶用Tris—Hcl缓冲液(0．1 mol／L，pH 7.0)定容配成浓度为1.0 mg／ml的酶液。称取2.0 g酪蛋白溶解于60 ml的Tfis—HCl溶液中，加热煮沸，冷却，Tfis—HCl缓冲液定容配成20 mg／ml的酪蛋白溶液。将HgCl2(或CuCl2)溶液、酶液和酪蛋白溶液按体积比1：1：3混合反应，

分别考察Hg2+和Cu2+对木瓜蛋白酶活性的影响。

双金属离子实验：根据单一金属离子实验结果，分别配置7个浓度梯度(10-3-10-9)的HgCl2和CuCl2溶液。按体积比1：1，将不同浓度两溶液两两配比成双金属离子溶液。双金属离子溶液、酶液和酪蛋白溶液按1：1：3体积比混合反应，研究双金属离子(Hg2+和Cu2+)对木瓜蛋白酶活性的影响。 2.3.2 酶活力测定

木瓜蛋白酶活力测定:取1．0 ml受试酶液于1.0 ml的Tfis—HCl溶液中，45℃预热10min。加入3．0 ml已预热的酪蛋白溶液，45℃下反应30 min，加入3.0 ml的10％三氯乙酸溶液，45℃振荡20 min后终止反应，过滤，取上清液，275 nm下UV测定。木瓜蛋白酶的1个酶活力单位(U)定义为45℃，pH 7.0条件下，单位时间(1 min)内水解酪蛋白产生lug酪氨酸的酶量。相对酶活以原酶酶活力为100％计。 2.3.3 结论

图一：当Hg2+和Cu2+浓度分别为10-6 mol／L和10-9mol／L时，木瓜蛋白酶相对酶活达到最高。当Hg2+和Cu2+浓度分别高于10-6和10-8 mol／L时，这2种金属离子对酶活力具有抑制作用。

表一：双金属Hg2+和Cu2+对木瓜蛋白酶的影响并非是各单一金属影响效应的简单相加。当Hg2+浓度高于10—4 mol／L时明显高于单一Hg2+在该浓度范围内的酶活，表明Cu2+对H92+的毒性有一定的缓解作用；当Hg2+浓度在10一5～10-6mol／L，Cu2+浓度低于10-5 mol／L时，酶活性提高(相对酶活>100％)，各酶活均高于单一金属离子在相应作用浓度的酶活，表明在这一浓度范围内，2种金属离子表现出协同激活作用；当Hg2+浓度在10-7～10-9 mol时，Cu2+的添加使各酶活均低于相应单一金属离子作用浓度下的酶活，表明在这一浓度范围内双金属离子表现出协同抑制作用。