10分钟，冷却室温后再3000g以上，室温离心10分钟，取上清检测。稀释倍数：5倍
处理后用试纸条进行检测比较合适。 7.3.1 测ENR标准品
将ENR工作液作系列稀释：500ng/ml，200ng/ml，96 ng/ml，48 ng/ml，24 ng/ml，8 ng/ml，1 ng/ml，同时设阴性对照，分别用试纸条进行测试，3个批次，两个重复试验。
将ENR工作液作系列稀释：10ng/ml，9 ng/ml，8 ng/ml，7 ng/ml，6 ng/ml，5 ng/ml，4 ng/ml，3 ng/ml，2 ng/ml，1 ng/ml，同时设阴性对照，分别用试纸条进行测试。3个批次，两个重复试验。
不同批次，不同重复试验的结果基本一致，结果见表17和表18 。由表可知，该试纸条检测含量在8ng/ml以上的ENR标准品时，结果都为阳性，检测7ng/ml的ENR标准品时，无法明确判断检测结果阴阳性，只能观测到样本试纸条检测线比对照试纸条检测线颜色浅，但差异不十分明显。多次重复后，将试纸条检测ENR标准品的检测线定为8ng/ml。
表17 试纸条检测限的确定：测ENR标准品（500～1 ng/ml）
ENR标准品（ng/ml） 阴性样本
结果判定
－
500 ＋
表18 试纸条检测限的确定：测ENR标准品（10～1 ng/ml）
ENR标准品(ng/ml) 阴性样本 10
结果判定
7.3.2 鸡肉组织样本添加试验
在ELISA检测为阴性的鸡肉组织样本中添加ENR标准品，添加浓度为500ng/ml，
－
9
8
7
6
5 －
4 －
3 －
2
1
200 ＋
96 ＋
48 ＋
24 ＋
8 ＋
1 －
＋ ＋ ＋ ＋/－ －
－ －
200ng/ml，100 ng/ml，50 ng/ml，25 ng/ml，8 ng/ml，1 ng/ml，另设阴性对照样本。所有样本用水做5倍稀释，分别用试纸条进行检测。3个批次，两个重复试验。
在ELISA检测为阴性的鸡肉组织样本中添加ENR标准品，添加浓度为100 ng/ml，90 ng/ml，80 ng/ml，70 ng/ml，60 ng/ml，50 ng/ml，40 ng/ml，30 ng/ml，20 ng/ml，10 ng/ml，另设阴性对照样本。所有样本用水做5倍稀释，分别用试纸条进行检测。3个批次，两个重复试验。
结果见表19和表20。由表可知，当5倍稀释的鸡肉组织样本中的ENR含量为8ng/ml以上时，试纸条的检测结果为阳性，据此推断鸡肉组织样本中试纸条的实际检测限为40 ng/ml。
表19 试纸条检测限的确定：鸡肉组织样本添加试验（1000～1 ng/ml） 提取后 鸡肉组织样本 (ng/ml) 检测结果
表20 试纸条检测限的确定：鸡肉组织样本添加试验（10～1 ng/ml） 提取后 鸡肉组织样本 (ng/ml) 检测结果 7.4
交叉反应试验
在空白组织中分别添加2000ng/ml，200ng/ml， 40 ng/ml的下列喹诺酮类药物：恩诺沙星、诺氟沙星、依诺沙星、氧氟沙星、达氟沙星、培氟沙星、环丙沙星、洛美沙星、噁喹酸、氟甲喹、麻保沙星 氨氟沙星、双氟沙星、沙拉沙星，同时设阴性对照，将所有的样本用水作稀释5倍后，用试纸条进行检测。每个浓度，每份样本作
－
＋ ＋ ＋ ＋/－
－
－ －
－
－ －
阴性样本 10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
－
＋
＋
＋
＋
＋
－
阴性样本
500
100
50
25
8
1
2次重复。
结果见表21。由表可知，添加浓度为2000ng/ml、200ng/ml、40ng/ml时，5倍稀释后试纸条对恩诺沙星一种喹诺酮类药物的检测结果都为阳性；这表明本实验研制的试纸条对恩诺沙星的交叉反应率为100％。对其它喹诺酮类药物的交叉反应率均小于1％。
表21 试纸条交叉反应试验
药物名称 阴性 恩诺沙星 － 诺氟沙星 － 依诺沙星 － 氧氟沙星 － 达氟沙星 － 培氟沙星 － 环丙沙星 － 2000 ＋ － － － － － － 200 ＋ － － － － － － 40 ＋ － － － － － － 药物名称 阴性 洛美沙星 噁喹酸 氟甲喹 麻保沙星 氨氟沙星 － － － － － 2000 200 － － － － － － － － － － － － － － 40 － － － － － － － 双氟沙星 － 沙拉沙星 －
7.5 重复性试验
实验过程中，由于金标抗体超速离心纯化时重现性较差，每批试纸条组装时都需组装少量试纸条作预实验，重新筛选适宜的浓缩纯化后金标抗体稀释倍数，金标抗体喷涂量以及包被抗原稀释倍数，同时检测不同浓度标准品使试纸条的检测灵敏度符合要求。
制作试纸条时影响因素较多，不同批次的试纸条在检测线显色深浅等方面会有一定的差异。试纸条的组装生产要求在洁净的环境条件下，室温恒定，湿度小于30％。实验室研发试纸条是在一个非标准的环境条件下，随季节气候的变化，实验室的温度、湿度都有一定的变化，这会影响到层析材料的性质和金标抗体的活性，对试剂的展开速度，检测线的显色都有影响。在试纸条的整个研发过程中，从金标抗体的喷涂，检测线上抗原的包被，玻璃纤维素膜的裁剪到试纸条的组装，大多采用手工操作，不可避免的会有一些操作误差。在以后的批量生产工作中，还需对生产流程进行细化，优
化，尽可能减小批间差异，保证不同批次试纸条的稳定性，重复性。
从3个批次的试纸条中分别随机抽取6条试纸条，用于测5倍稀释的阴性鸡肉组织样本，8ng/ml的ENR标准品，40ng/ml添加浓度的鸡肉组织样本，每个样本作2次重复。
结果见表22。由表可知，从3个批次的试纸条中随机抽取的试纸条对5倍稀释阴性鸡肉组织样本、8ng/ml ENR标准品、40ng/ml添加浓度鸡肉组织样本检测结果一致，说明不同批次间试纸条重复性较好。
表22 试纸条重复性试验
批次A 批次B 批次C
7.6 保存试验
将制作好的试纸条两条一组置于铝箔袋中，加干燥剂密闭包装，分别置于4℃、 37℃、 室温（20～25℃）条件下，其中置于4℃和室温条件的试纸条每隔7天取出两组，置于37℃每天取出两组，分别检测阴性样本和40ng/ml阳性样本。观察检测线的有无，颜色深浅及玻璃纤维素膜上金标抗体的释放程度。4℃和室温条件下的保存试验持续3个月，37℃条件下保存试验持续7天。
密闭保存于4℃、室温（20～25℃）条件下的试纸条在12次24组检测试验中，检测阴性样本水时检测线清晰，背景白色，结合释放垫上金标抗体释放完全；检测40ng/ml标准品时，对照试纸条检测线清晰，测样试纸条检测线完全消失，符合实验要求。试纸条在37℃条件下的保存到第6天，检测阴性样本水时检测线颜色开始变浅，第7天对照试纸条检测线颜色已很浅，模糊不清。最后确定试纸条的保存条件是两条一组置于铝箔袋中抽真空、加干燥剂室温密闭保存 7.7 实际测样试验
鸡肉组织样本处理方法：称取2g匀浆好得组织于离心管中，加入10ml PH7.2
稀释阴性鸡肉组织样本
－ － －
－ － －
8ng/mlENR标准品 ＋ ＋ ＋
＋ ＋ ＋
40ng/ml添加浓度鸡肉组织样本
＋ ＋ ＋
＋ ＋ ＋
0.02mol/L磷酸盐缓冲液，80度水浴10分钟，冷却室温后再3000g以上，室温离心10分钟，取上清检测。稀释倍数：5倍，处理后用试纸条进行检测比较合适。将上清分别用水作提取后，各取100μl用ELISA试剂盒直接进行检测，再各取100μl用试纸条进行检测。 。
试纸条对提取后的300份鸡肉组织样本的结果见表23。300份鸡肉组织样本中有253份为阴性，其余47份样本检测结果为阳性。其中130、217、184号样本ELISA方法检测为阴性，而试纸条显示为阳性。
ELISA试剂盒对5倍稀释后的300份鸡肉组织样本的结果见表24，含量大于40ng/ml判断为阳性，小于40ng/ml判断为阴性。300份鸡肉组织样本中有256份阴性样本，其余44份鸡肉组织样本为阳性
从该表可以看出，试纸条检测结果和ELISA检测结果阳性样本符合率为100％，阴性样本符合率约为93%以上。
如图5～11，为试纸卡检测1～100号的鸡肉样本照片，为了简洁以下检测样本照片略。
恩诺沙星胶体金免疫层析试纸条的技术报告
