6.1.2孔径大小：孔径大小是一个关键因素，免疫层析试验使用的膜孔径多为0.5～1.0μm。
6.1.3层析速率：层析速率可用两种方式表示，单位时间层析流动的距离(cm/min)和单位长度层析流动所需时间(s/4cm)。本试验供筛选的4种NC膜的层析速率见表9：
表9 NC膜的层析速率
膜的类型 AE99 AE 98 Fast ND 140 AE 100
层析速率(s/4cm)
120～160 110～160 130～150 90～120
厚度(μm) 120 120 120 120
6.1.4膜的厚度：厚度对层析速率影响不大。
6.1.5抗张强度：膜的可拉伸强度和弹性范围，如果膜的抗张强度太低在制备过程中会出现类似于断膜等许多问题。 6.2 硝酸纤维素（NC）膜的选择
6.1.1 用包被抗原在AE99、AE98 Fast、ND 140、AE100四种NC膜上分别点样，干燥、封闭后再分别滴加金标抗体溶液，比较不同膜的显色情况。
6.1.2 用AE99、AE98 Fast、ND 140、AE100四种NC膜分别组装试纸条，比较不同膜的层析速度，比较相同时间内不同膜上检测线的显色情况。
表10 NC膜点样显色结果
NC膜型号 显色情况
AE99 ＋＋＋
AE98 Fast ＋＋＋
ND 140 ＋＋＋
AE100 ＋＋＋
由表可知，不同NC膜点样显色颜色都很深，没有明显区别。
6.1.3不同NC膜组装的试纸条试剂展开速度和加样5min后的检测线显色结果见表11。
表11 NC膜层析显色结果
NC膜型号 试剂展开速度（s）
AE99 87
AE98 Fast
70
ND 140 135
AE100 65
5min后检测线显色情况 ＋＋＋ ＋ ＋＋ ＋
由表可知，AE98 Fast、AE100试剂展开速度较快，5min内检测线显色较浅，AE98、AE99试剂展开速度较慢，AE99 上检测线显色较ND 140上检测线显色深，且背景颜色很浅，四种膜中，AE99更符合试纸条设计要求。
金标垫多采用玻璃纤维素等蛋白质吸附性低的纤维素膜。样品垫多采用玻璃纤维或纤维素滤膜，玻璃纤维吸收量小，一般用于测定血液制品，纤维素膜吸收量大，一般用于尿样或大量体液的检测，并可在其中加入一定的封闭剂或增稠剂以优化试验过程。吸收垫多采用具有高吸水能力的纤维素滤膜，通过改变吸收垫的大小可以调整试验结束的时间。背衬板用于支撑NC膜，一般为附有压力敏感胶的聚脂板或塑料板。 6.2.1 结合释放垫的选择
将稀释好的金标抗体滴加在Glass 33、Glass 24 、GFC20300，温箱烘干后，组装试纸条，比较不同玻璃纤维素膜上金标抗体的释放情况，比较NC膜上的检测线显色情况。
表12 结合释放垫选择结果
玻璃纤维素膜 金标抗体释放情况 检测线显色情况
Glass 33 少量残余 ＋＋
Glass 24 少量残余 ＋＋
GFC20300 释放完全 ＋＋＋
结果见表12。由表可知Glass 24组装的试纸条上检测线较GFC20300组装的试纸条上检测线颜色浅，检测完成后GFC20300上有少量的金标抗体残余。故选择Glass 33作为结合释放垫。 6.2.2 样品垫的选择
用CB-SB08 、CB-SB06、Glass 33组装试纸条，各滴加100μl的样品，5min后比较样品垫对样品的吸收情况，比较NC膜上的检测线显色情况。
结果见表13。由表可知，3种样品垫都能完全吸收100μl样品，5min后Glass 33组装的试纸条检测线显色较其他两种颜色深，故选择Glass 33作为样品垫。
表13 样品垫选择结果
样品垫型号
CB-SB08
CB-SB06
Glass 33
样品吸收情况 检测线显色情况 6.2.3 吸收垫的选择
吸收完全 ＋＋
吸收完全 ＋＋
吸收完全 ＋＋＋
用Cotton linters 2668，Cotton linters 300， Cotton linters 900三种棉线纸张分别组装试纸条，比较各棉线纸张的厚度、对层析反应后样品溶液的吸收情况。
结果见表14。由表可知，3种吸收垫5min内都能将由NC膜层析过去的样品溶液吸收完全。3种膜的厚度分别为：0.90mm、1.83mm、2.59mm，考虑到Glass 33和，NC膜AE99的厚度，故Cotton linters 2668 与试纸条的其他材料匹配较佳。
表14 吸收垫选择结果
吸收垫型号 层析后溶液吸收情况
6.4 金标抗体喷涂量的选择
结合释放垫上金标抗体的喷涂量对试纸条的灵敏度有很大的影响，但金标抗体的喷涂量不是一个固定不变的值。胶体金标记抗体蛋白过程中，标记时胶体金溶液的pH值固定，稳定胶体金的最佳蛋白用量固定，标记时搅拌子转速固定，标记所用时间固定，但金标抗体在低温超速离心纯化后浓度有较大差异。同样的转速，超速离心后有时离心管管底有致密黑色金颗粒贴壁，有时没有，这必然导致纯化后金标抗体浓度的不同。不同批次的金标抗体在往结合释放垫上喷涂时都需要做预实验，先调节包被抗原浓度，调节金标抗体稀释倍数，组装少量试纸条测试ENR标准品，符合检测要求才能组装其他试纸条。
按每1cm2玻璃纤维素膜(Glass 33)喷涂70μl、80μl和90μl金标抗体，将稀释后的金标抗体滴加到玻璃纤维素膜上，干燥后分别组装试纸条。将阴性鸡肉样本40ng/ml、60ng/ml、80ng/ml的鸡肉样本分别作5倍稀释，用组装好的试纸条进行测试。
结果见表15。从表中可知，金标抗体喷涂量为70μl/cm2时，检测5倍稀释的40ng/ml鸡肉样本结果为阳性灵敏度过高，出现了假阳性现象，而金标抗体喷涂量为
2668 吸收完全
300 吸收完全
900 吸收完全
90μl/cm2时，检测5倍稀释的60ng/ml的鸡肉样本，结果为阴性，即试纸条NC膜上能看到检测线，试纸条灵敏度降低。多次重复试验后，决定采用80μl/cm2作为Glass 33上金标抗体的喷涂量。
表15 金标抗体喷涂量选择结果
金标抗体喷涂量（μl/cm2）
阴性样本(5倍) 40ng/ml(5倍) 60ng/ml(5倍) 80ng/ml(5倍)
1.15 NC膜上抗原包被浓度的选择
在ENR抗体固定不变的情况下，影响试纸条灵敏度的因素主要是NC膜上包被抗原的包被浓度和结合释放垫上金标抗体的喷涂量。将包被抗原做系列稀释在NC膜上划线，和喷涂有不同浓度金标抗体的结合释放垫组装试纸条，检测ENR标准品，多次重复后可确定包被抗原的包被浓度。
将包被抗原溶液稀释到0.1mg/ml、0.2.mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml分别在NC膜上划线，干燥后分别滴加100μl 5倍体积浸泡后的阴性鸡肉样本40ng/ml、60ng/ml、80ng/ml的鸡肉样本。
结果见表16。由表可知，当包被抗原包被浓度为0.1mg/ml时，检测线中包被的抗原量过少，滴加5倍稀释的阴性样本后，随样本溶液迁移到检测线位置的金标抗体同包被抗原结合后，滞留在检测线位置的胶体金颗粒数量过少，不足以达到肉眼可见程度，即检测线位置没有肉眼可见的红色线条出现，因而出现假阳性现象。同理，当包被抗原浓度为0.4mg/ml和0.3mg/ml时，检测灵敏度降低，无法满足检测需求。故包被抗原的包被浓度选择为0.2mg/ml。
表16 包被抗原包被浓度选择结果
包被抗原包被浓度
（mg/ml） 阴性样本(5倍)
＋
－
－
－
0.1
0.2
0.3
0.4
70 － ＋ ＋ ＋
80 － － ＋ ＋
90 － － － ＋
40ng/ml(5倍) 60ng/ml(5倍) 80ng/ml(5倍) 7 试纸条的组装和测试 7.1 试纸条的组装
＋ ＋ ＋
－ ＋ ＋
－ － ＋
－ － －
图4 试纸条组装示意图
如图4所示，在塑料背板上依次粘贴样品垫，结合释放垫，硝酸纤维素膜，吸收垫，并在样品垫外面粘贴保护膜。 7.2 试纸条的测试
每次用试纸条进行测试均需设对照试纸条：用移液枪在普通酶标板小孔中滴加100μl水或100μl 5倍稀释的ELISA检测为阴性的鸡肉组织样本，插入试纸条，使样品垫一侧浸入样本溶液中。
样本测试方法：将待测鸡肉组织样本用水稀释5倍，混匀后取100μl加入酶标板小孔，插入试纸条。通过样本试纸条和对照试纸条检测线的显色情况比较来判断待测样本的阴阳性。
阴阳性判断标准：如样本试纸条的检测线和对照试纸条的检测线颜色深浅基本一致或略浅，结果判断为阴性，如果样本试纸条检测线没有出现或检测线颜色明显浅于对照试纸条检测线，结果判断为阳性。 7.3 试纸条检测限的确定
本实验中试纸条检测限的确定是采用测定ENR标准品和添加了ENR的阴性的鸡肉组织样本。由于组织成分比较复杂，经过多次摸索，组织样本处理方法：称取2g匀浆好得组织于离心管中，加入10ml PH 7.2 0.02mol/L磷酸盐缓冲液，80度水浴
恩诺沙星胶体金免疫层析试纸条的技术报告
