恩诺沙星胶体金免疫层析试纸条的技术报告
1.1 胶体金的制备 1.1 玻璃器皿的准备
玻璃器皿表面的少量污染会干扰金颗粒的生成，一切玻璃容器应绝对清洁，用前经过酸洗，硅化。硅化过程一般是将玻璃容器浸泡于含5％二氯二甲硅烷的氯仿溶液中1min，室温干燥后蒸馏水冲洗，再干燥备用。专用的玻璃器皿以第一次生成的胶体金稳定其表面，弃去后以双蒸馏水淋洗，可代替硅化处理。
将玻璃器皿用酸液浸泡72小时后，取出，大量自来水冲洗，洗洁精洗涤，蒸馏水浸泡24h后用去离子水冲洗三次，37℃温箱烘干后备用。 1.2 柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液
在胶体金免疫层析试验中，检测信号是由于金颗粒在检测线或质控线上聚集而成，所以如果金颗粒太小就不能产生足够的颜色信号，如果太大又会遇到空间位阻问题。空间位阻可以阻止小分子蛋白质接近金颗粒的zeta电位，例如IgG分子(160 000 Daltons)大约8nm，约有4nm可以与金颗粒的表面结合，其最适的标记金颗粒为40nm，而对小分子抗原来说，可以使用20nm的胶体金颗粒进行标记[67]。本实验中直接制备20nm胶体金用于ENR抗体的标记，结果比较理想。
取0.01％氯金酸水溶液100ml用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，持续搅拌的情况下加入1％柠檬酸三钠水溶液1ml，继续搅拌加热20min，溶液呈透亮的红色。室温冷却，用去离子水恢复到原体积，4℃保存。 1.3. 胶体金的质量鉴定 1.3.1 肉眼观察
用肉眼观察制备的胶体金，其颜色为酒红色、均匀度较好无杂质、透明度较高。 1.3.2 紫外扫描鉴定
取冷却后的胶体金溶液进行400～600nm紫外扫描，确定最大吸收峰波长，观察最大吸收峰的峰形、峰宽。
胶体金溶液400～600nm的紫外扫描图谱见图1。
图 1 胶体金溶液400～600nm紫外扫描图谱
1.1.3.3 透射电镜鉴定
透射电镜下观察胶体金颗粒的大小是否均匀一致，有无椭圆形及多角形。拍片放大后测量胶体金颗粒直径大小，取多个点计算胶体金颗粒的平均直径。胶体金颗粒的透射电镜扫描图片见图2。
图2 胶体金电镜扫描图片(电压：40.0kV，放大倍数：40.0k)
在透射电镜下观察到胶体金颗粒的大小基本一致，没有椭圆形、多角形的金颗粒。将照片扫描后转换成电子版图片，放大后测量胶体金颗粒直径大小。随机挑选10个
胶体金颗粒通过计算得到金颗粒平均直径为23.5±0.5nm，与紫外扫描鉴定法得到的颗粒直径接近。 2 抗体制备
取健康经产Balb/c母鼠或雄鼠，每只注射1ml灭菌石蜡油，15天后注射1ml杂交瘤细胞细胞(含1×103细胞)，约7～10天后采集腹水。每只小鼠可采腹水约2～3ml。离心去脂肪层和细胞层后，用硫酸铵纯化后分装冻存。
腹水单抗的制备 给Balb/c小鼠腹腔注射灭菌液体石蜡2.5mL/只, 7～14天后同途径接种经克隆化培养后的杂交瘤细胞0.5mL/(1×103～2×103个), 经10天左右抽取腹水, 离心去除油脂和沉淀后,即为小鼠腹水单抗。
单抗效价测定 将腹水或细胞上清倍比稀释后, 按间接ELISA操作流程进行测定。主要操作如下：用包被缓冲液将包被用抗原OVA-ENR稀释至适当的工作浓度, 每微孔加100μl，4℃过夜, 弃去孔内的液体。每孔加封闭液200μl，37℃水浴保持2小时后用洗涤缓冲液洗3次，将腹水或细胞上清倍比稀释后按顺序加入，每孔100μl, 每块板同时设空白对照、阴性对照和阳性对照各2孔。37℃水浴1小时，每孔加适当浓度的酶标二抗100ul，置37℃水浴1小时。每孔加新鲜配置的TMB底物液100μl，37℃水浴10～30分钟。每孔加终止液50μl。以待测孔光密度值(OD值)大于或等于阴性对照孔的2.1倍判为阳性。以判为阳性的最高稀释倍数为效价判定终点效价。重复3次, 计算平均值。
交叉反应试验 将ENR和其结构类似物环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、洛美沙星偶联载体BSA、OVA倍比稀释，每个浓度分别取100ul与100ul工作浓度的腹水在37℃水浴反应1小时，再加入到包被封闭好的酶标板微孔内反应1小时。然后按间接ELISA操作流程加单抗及HRP-羊抗鼠IgG, 测定OD450值, 并计算交叉反应率，即Y=S/Z×100%，其中S表示恩诺沙星与50%抗体结合时的浓度，Z表示类似物与50%抗体结合时的浓度。
对恩诺沙星的检测灵敏度测定： 方法同交叉反应试验, 将不同浓度
（0ppb-100ppb）的恩诺沙星作为标准品代替类似物进行试验, 最后测定OD450值, 并计算抑制率(N-P)/N值(N为零标准品OD值, P为其它标准品OD值)。用抑制率作纵坐标,标准品浓度的对数值作横坐标绘制标准曲线。测定10个零标准管, 求出光密度
值的平均数X，再减去2倍标准差，从标准曲线上查出对应于光密度值为X-2SD的浓度，即为灵敏度。 3 胶体金标记抗体蛋白
胶体金标记蛋白实质上是抗体蛋白等生物大分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是胶体金颗粒表面带负电荷，与蛋白质分子的正电荷之间靠静电力相互吸引，达到范德华引力范围内即形成牢固的结合。胶体金颗粒的粗糙表面也是利于形成吸附的重要条件。由于结合过程主要是物理吸附作用，并不影响蛋白质的生物活性。
由于盐类成分能影响金颗粒对蛋白质的吸附，并可使金颗粒聚沉，故标记前应先用低离子浓度的水透析，以除去多余的盐。
胶体金对蛋白质的吸附主要取决于pH值，在接近蛋白质的等电点或略偏碱的条件下，二者容易形成牢固的结合物。 3.1 抗体蛋白的处理
将待标记的抗体蛋白溶液用0.002mol/L的NaCl(pH 7.0) 4℃透析过夜，除去多余的盐离子，40000g 4℃ 离心 1h，除去聚合物。 3.2 胶体金溶液的准备
用0.1 mol/L K2CO3 或 0.1mol/L HCl 调节胶体金溶液的pH值为6.0。由于金颗粒容易吸附于电极上使之堵塞，故不能用pH计测定金溶液的pH值，一般使用精密pH试纸。
3.3 稳定胶体金最适抗体蛋白用量的选择 3.3.1 分光光度计测定法
将经过高速离心处理后的抗体用2 mmol/L 硼酸缓冲液（pH 9.0）稀释至0.5mg/ml。稀释后抗体和其他试剂按表1逐项操作。
表1 最适蛋白用量分光光度计测定法步骤
试剂
1
抗体（μg）
5
2 10
3 15
4 20
试验管 5 25
6 30
7 35
8 40
9 45
10 50
对照管 1 H2O
100μl
胶体金（ml） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
摇匀，静置5min
10% NaCl (μl) 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
摇匀，静置5min后，测定520nm处OD值
以OD值为纵坐标，抗体蛋白用量为横坐标做一曲线，取曲线与横坐标接近那一点的抗体蛋白用量即为稳定胶体金的最小蛋白用量。在此基础上再加10%～20%即为稳定胶体金的抗体蛋白实际用量。结果见图3。
0.90.81.0
0
O.D. 520nm0.70.60.50.40.3010203040单抗添加量（μg/ml）5060
图3 最适蛋白用量分光光度计测定法
由图可知，当每1ml胶体金溶液中单抗添加量等于或大于28μg/ml时，胶体金蛋白结合物的光密度值不再发生较大的变化，趋于平稳，说明胶体金颗粒对抗体蛋白的吸附基本达到饱和，稳定胶体金的最小蛋白用量为每1ml金溶液中添加28μg抗体蛋白，在此基础上再增加10～20％即为待标记抗体蛋白的实际用量。最终确定实际蛋白用量为每1ml胶体金溶液中添加33.6μg抗体蛋白。 3.3.2目测法
具体步骤：
（1） 0.1 mol/L K2CO3 或 0.1mol/L HCl 调节胶体金溶液pH为6.0。 （2） 将pH6.0 的胶体金溶液分装10管，每管 1ml。
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