第七章 病毒的检测 一、病毒的分离鉴定 病料的采集
病料采集后的保存 病毒材料的处理 病毒材料的接种
组织培养细胞中病毒增殖的判定 病毒感染力的滴定 病毒理化学特性的测定 （一）病料采集的基本原则 尽量无菌操作，避免细菌污染
尽早采集病料，尽快送检，低温运输
根据动物及病毒的种类不同采集不同的组织病料 同一疾病，不同病程取不同标本
检材容器贴上标签，并在相应化验单详细填写检验目的、标本种类、临床诊断及其他常规项目
（二）病料采集后的保存 采集病料后应尽快冷藏保存
-30℃可保存几个月，-70℃可保存几年
怀疑为疱疹病毒的感染材料，可置-50℃以下温度或4℃保存
现场采集病料，应尽快置冰—盐混合的冰瓶内，送往实验室或冷藏地点。 （三）病毒材料的处理
1. 脑、心、肝、脾、肺、肾、肌肉等器官或组织
充分研磨后加入5倍量的Hank’s液（内含青霉素、链霉素各200U/ml），反复冻融3次。2000r/min离心 10min，取上清作接种物。 幻灯片6
2. 鼻液、乳汁、脓汁等分泌物或渗出物
用内含1000u/ml青、链霉素（P.S）的Hank’s液，将其稀释3-5倍，充分混匀悬浮后，置4℃冰箱内感作2-4h或过夜，2000r/min 10min取上清作接种物。 幻灯片7
3. 咽喉拭子或鼻拭子
用棉拭子擦拭咽喉部或鼻部，并迅速将其泡入盛有2-5ml Hank’s液（200-500u/ml P.S）的试管内，充分涮洗棉拭子，反复冻融3-5次，收集液体部分，2000r/min 10min，收集上清作接种物。 幻灯片8 4. 粪便
用棉拭子插入肛门沾取或扑杀病畜后由肠管采集。用含1000u/ml P.S的Hank’s液作10-20倍稀释，4℃感作4h，2000r/min 10min取上清作接种物。 5. 无菌的体液或鸡胚液 直接作接种用 （四）病毒材料的接种 1. 本动物 2. 实验动物 3. 鸡胚
4. 组织培养细胞
1. 本动物 马传贫病毒、猪瘟病毒、鸡瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒 2. 实验动物
3. 鸡胚 正粘病毒、副粘病毒、痘病毒、脑炎病毒 4. 组织培养细胞
（五）组织培养细胞中病毒增殖的判定 1. 细胞病变（cytopathic effect, CPE）
腺病毒：细胞肿大、颗粒增多、病变细胞呈葡萄串状。 伪狂犬病毒：细胞圆缩、脱落、裂解，形成合胞体。 正常的Marc-145细胞 病变的Marc-145细胞 幻灯片13
A：正常PK-15 B、C、D：感染PRV的PK-15 幻灯片14
口蹄疫病毒在BHK-21细胞上的病变 幻灯片15
2. 细胞代谢的测定
细胞正常，营养液pH下降
大多数病毒感染后，营养液pH下降不明显或上升。 少数病毒感染后，营养液pH下降（腺病毒、PRRSV) 3. 抗原的测定
间接免疫荧光(immunofluorescence) SDS-PAGE & western blot 4. 中和试验
7. 电子显微镜观察 8. PCR扩增
9. 实验动物或鸡胚接种 （六）病毒感染力的滴定
半数致死量（50% lethal dose, LD50） 半数感染量（50% infective dose, ID50）
鸡胚半数感染量（50% egg infective dose, EID50）
组织培养半数感染量(50% tissue culture infective dose, TCID50) 蚀斑形成单位(plaque forming unit, PFU） （七）病毒理化学特性的测定 病毒核酸型鉴定 脂溶剂敏感性试验 胰蛋白酶敏感试验 耐酸性试验 耐热性试验
病毒粒子大小的测定
病毒对理化因子敏感的判定标准：试验组的TCID50比对照组低2个对数以上判为阳性。 试验组 对照组 TCID50/0.1mL 10-2 10-5 幻灯片20
1、病毒核酸型鉴定（药物抑制试验） FUDR、IUDR、BrUDR（5-溴脱氧尿苷）
原理：FUDR、IUDR、BrUDR是嘧啶的卤化物，进入细胞后发生磷酸化，掺入新合成的DNA以代替胸腺嘧啶，产生无功能分子，从而抑制DNA的合成。常用浓度为50ug/ml。 2、脂溶剂敏感性试验 （1）乙醚敏感试验
用终浓度为20%的乙醚处理病毒（4℃内作用24h），离心取病毒液；同时设对照。滴定两组病毒的TCID50。 （2）氯仿敏感性试验
用终浓度为4.8%的分析纯氯仿处理病毒（4℃振荡混合10min）。随后离心取病毒液。同时设对照。测定两组病毒的TCID50 3、胰蛋白酶敏感试验
脊髓灰质炎病毒、猪传染性胃肠炎病毒对胰酶有较强的抵抗力 痘病毒、呼肠孤病毒、疱疹病毒易被胰酶灭活
用终浓度为0.5%的胰蛋白酶处理病毒液（37℃ 1h），然后加入灭活犊牛血清8ml终止胰酶的作用。同时设对照。最后滴定两瓶病毒的TCID50。 4、耐酸性试验
用0.1mol/L HCl将病毒液的pH调至3.0(or 5.0) 37℃水溶或室温中感作2h(or 1h)
用5.6% NaHCO3溶液将pH调回至7.2左右。 对照组加入等量的培养液同样处理。 测定两者的TCID50。 5、耐热性试验
将病毒液分成若干瓶，留1小瓶作对照，其余的置不同温度下作用相同时间或置相同温度下作用不同时间。然后测定每瓶病毒的TCID50。 50℃、60℃、70℃、80℃水溶1h
50℃水浴5、10、15、30、60、180min 6、病毒粒子大小测定 (1) 电子显微镜直接观察
磷钨酸负染后，透射电镜观察 (2) 超速离心沉淀 幻灯片26 (3) 滤过试验
将病毒液依次通过不同孔经（450nm、225nm、100nm和50nm）的滤膜，每通过一种孔径的滤膜吸取1ml滤液作为样品。最后测定原病毒液以及各级滤液的TCID50。 病毒液种类 TCID50/0.1ml 滤前病毒液 10-6.75 450nm孔径液 10-6.23 225nm孔径液 10-5.78 100nm孔径液 10-4.50 50nm孔径液 10-0.50 二、免疫学检测 中和试验（SNT） 凝集试验
血凝和血凝抑制试验（HA and HI) 补体结合试验
琼脂扩散试验 免疫标记技术 （一）中和试验
原理：抗体与相应的病毒粒子特异性地结合，使后者丧失感染能力。 用途: 疾病诊断
病毒分离株的鉴定
不同病毒株的抗原关系研究 疫苗免疫原性的评价 免疫血清的质量评价
测定实验动物血清中是否存在抗体 中和试验分类
1、终点法中和试验
固定病毒-稀释血清法中和试验 固定血清-稀释病毒法中和试验 2、蚀（噬）斑（痘斑）减数试验 3、交叉保护试验
2、蚀（噬）斑减数试验 （1）蚀斑技术
病毒蚀斑：又称空斑，指病毒在已长成的单层细胞上形成的局限性病灶。 原理：将病毒悬液作适当的稀释接种于已经长成单层的敏感细胞上，再在单层细胞上覆盖一层固体介质（琼脂糖、甲基纤维素），经过几个增殖周期后，形成一个局限性的肉眼可见的病变细胞区，即局限性的病灶。
TK-突变株与野毒株的形成空斑的比较
蚀斑形成单位（plaque forming unit, PFU)：每毫升病毒悬液中所含的蚀斑数。 蚀斑技术的用途： ①用于病毒纯化
②测定病毒悬液中感染性病毒的含量 （2）蚀斑减数试验 3、交叉保护试验 用途：
（1）应用已知病毒鉴定未知病毒 （2）应用已知免疫血清鉴定未知病毒 （3）应用已知病毒鉴定未知血清 缺点：试验周期太长
需要大量的实验动物 （二）凝集试验 1、概念
颗粒性Ag（如细菌、红细胞等）或表面载有Ag或Ab的颗粒性物质在电解质存在下凝集成团的试验。
致敏：将可溶性Ag或Ab吸附到载体颗粒表面的过程。
常用的载体物质：聚苯乙烯乳胶、红细胞、炭素、脂质体、皂土等 幻灯片37 2、分类
1）根据致敏物质的不同分为： 间接凝集试验（被动凝集试验）：Ag致敏 致敏Ag+被检Ab
反向间接凝集试验（反向被动凝集试验）：Ab致敏 致敏Ab+被检Ag
2）根据所用载体物质的不同分为： 红细胞凝集试验(间接血凝试验）：FMDV、CSFV 乳胶凝集试验：PRV、PPV、JEV 炭凝集试验 皂土凝集试验 脂质体凝集试验
伪狂犬病乳胶凝集试验（LAT）
（三）免疫标记技术(immunolabelling techniques）
使用荧光素、酶、放射性核素、铁蛋白、胶体金及化学（或生物）发光剂等作为示踪物，对抗原或抗体标记后进行的抗原抗体反应。 借助荧光显微镜、酶标检测仪、射线测定仪等，对实验结果直接镜检观察或进行自动化测定。 免疫标记技术分类 免疫荧光技术 免疫酶技术 胶体金标记技术 放射免疫测定技术 铁蛋白标记技术 免疫酶技术
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
原理 将已知抗原或抗体结合在某种固相载体上，将待检标本和酶标抗体或抗原按不同步骤与固相载体表面吸附的抗原或抗体发生反应，再用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离成分，然后加入酶的作用底物催化显色，进行定性或定量。 免疫酶技术
HRP的底物为过氧化物（H2O2、过氧化脲、葡萄糖-葡萄糖氧化酶系统）。作用原理是催化过氧化氢分解，产生原子态[O]，后者使底物中的供氢体氧化，生成有色的氧化型染料。 联苯亚胺（棕色） 常用ELISA方法 间接法
双抗体夹心法 竞争法
阻断ELISA 间接法
用已知Ag包被板子+Ab（未知）+酶标抗Ab+酶底物显色 双抗体夹心法(用于检测Ag)
Ab+Ag（未知）+酶标Ab+酶底物显色 竞争法(测定Ag)
利用酶标记Ag和未标记Ag共同竞争有限量的Ab，测定样品中的Ab。 需同时做只加酶标记Ag的系统作对照。
试验组：Ab+待检Ag和酶标记Ag（也可先加待检样品，稍后再加酶标记Ag）。
第七章 病毒的检测
