第一章 绪论
食品生物技术的含义 : 现代生物技术在食品领域中的应用，以现代生命科学的研究成果为基础，结合现代工程技术手段和其他学科的研究成果，用全新的方法和手段设计新型的食品和食品原料 基因工程：也就是DNA重组技术，是用人工的方法把不同生物的遗传物质（基因）分离出来，在体外进行剪切、拼接、重组，形成重组体，然后再把重组体引入宿主细胞中得以高效表达，最终获得人们所需要的基因产物。 目的：把一个生物体中的遗传信息转入到另一个生物体中 典型步骤：
1）克隆：提取供体生物的目的基因，通过限制性内切酶、DNA聚合酶连接到另一个载体的DNA分子上，形成一个新的重组DNA分子
2）转化：将这个重组DNA分子转入受体细胞并在受体细胞中复制保存 3）将那些吸收了重组DNA的受体细胞进行筛选和鉴定
4）对含有重组DNA的细胞进行大量培养，检测外源基因是否表达 细胞工程：细胞水平研究开发、利用各类细胞的工程
技术可分为8大类： 组织与细胞培养技术； 细胞融合技术； 细胞大量培养技术；细胞器移植技术，DNA重组技术，外源基因导入技术，体外受精和胚胎移植，染色体工程技术 蛋白质工程：在基因工程的基础上，结合蛋白质结晶学，计算机辅助设计和蛋白质化学等多学科的基础知识,通过对基因的人工定向改造等手段，对蛋白质进行修饰、改造和拼接以生产出能满足人类需要的新型蛋白质的技术。
酶工程：利用酶的催化作用进行物质转化的技术，是酶学理论、基因工程、蛋白质工程、发酵工程相结合形成的一门新技术。
发酵工程：生物技术产业化的重要环节。现代发酵工程是将微生物学、生物化学和化学工程等学科基本原理有机结合，是建立在基因工程技术基础上的一门应用技术性学科。 基因工程技术是建立在分子生物学和分子遗传学理论发展基础之上的技术 第二章 基因工程 基因工程研究的理论依据
(1)不同基因具有相同的物质基础:具有遗传功能的特定核苷酸序列的DNA片段 (2)基因是可切割的：大多数基因彼此之间存在着间隔序列
(3)基因是可以转移的：基因可在不同生物之间转移，或在染色体DNA上移动 (4)多肽与基因之间存在对应关系：普遍认为，一种多肽就有一种相应的基因
(5)遗传密码是通用的：一系列三联密码子同氨基酸之间的对应关系，在所有生物中都是相同的
(6)基因可通过复制把遗传信息传递给下一代：经重组的基因一般来说是能传代的
限制性内切酶的定义指一类能识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并在识别序列内或附近特异切割双链DNA的核酸内切酶。
主要存在于原核生物，是原核生物自我保护的机制（限制修饰系统）的一部分。
至今发现的限制性内切酶有三种类型，各具特性，基因工程操作中真正有用的是II型酶。 限制性内切酶的分类根据限制性内切酶的识别位点和切割位点及所需要的辅助因子，可分为3种不同类型。 I 型：切割位点不确定，不适用于基因工程。限制所需要的辅助因子: ATP、 Mg2+和SAM 作用原理：识别双链DNA未甲基化修饰的特异序列，与该序列相互作用，然后延DNA分子移动，在距离特异性识别位点约1000-1500bp处随机切开一条单链。
? Ⅱ型：基因工程的工具酶。限制所需要的辅助因子: ATP、 Mg2+和SAM
? 作用机理：能完全肯定的识别位点和切割位点，但切割位点也是在识别位点的一侧
的一定距离 酶切位点：DNA在限制性内切酶的作用下，使多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置，可用?表示。酶切切口
平齐末端：在识别序列内的对称轴上切割，其 切割产物具平头末端（不易重新连接）。 粘性末端：在识别序列2条链对应位上错位切割，有5’端突出的粘性末端和3’端突出的粘性末端。
同裂酶：来源不同，但识别序列相同的限制性内切酶
同尾酶 ：识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端的限制性内切酶。 同尾酶的粘性末端结合形成的新位点 不能再被原来的酶识别 Ⅲ型：切割位点不在识别位点，对分子克隆操作亦无实用意义。限制所需要的辅助因子: Mg2+ 作用原理：识别双链DNA上一 小段明确的特殊序列（多数是回文序列），然后在识别位点之内的特定位置切割。
? 常用限制酶EcoRI、HindIII、BamHI
? 酶反应系统：底物DNA、反应缓冲液、酶、一定的反应温度和时间。 能将两段DNA拼接起来的酶称为DNA连接酶
? 功能 ：催化DNA相邻的5‘磷酸基团和3’羟基末端之间形成磷酸二酯键，将DNA单
链缺口封合起来 种类及作用机理 ◆ T4 DNA连接酶
ATP提供能量； 连接粘性末端和平齐末端。 ◆ 大肠杆菌DNA连接酶
NAD+提供能量； 连接粘性末端
? DNA聚合酶的活性: 催化DNA合成及其相辅的活性。
? 真核细胞中的DNA聚合酶: 4种， DNA聚合酶α、β、γ、线粒体DNA聚合酶。 ? 原核细胞中的DNA聚合酶: 3种，DNA聚合酶I、 DNA聚合酶II和DNA聚合酶III。
常用的DNA聚合酶：一、大肠杆菌DNA聚合酶 二、Klenow 片段 三、T4 噬菌体DNA聚合酶 四、T7 噬菌体DNA聚合酶 五、耐热DNA聚合酶 六、末端转移酶 七、反转录酶
基因载体是一类将外源DNA或基因带入宿主细胞的能自我复制的DNA分子。其中的一段DNA被切除而不影响其复制，可用以置换或插入外源(目的) DNA而将目的DNA带入宿主细胞。
理想的基因工程载体应具备的特征
1.能在宿主细胞内独立和稳定的自我复制； 2.易于从宿主细胞中分离，便于纯化； 3.具有多种单一的限制性内切酶酶切位点 4.具有合适的遗传标记基因。 按分子生物学特性，载体划分为
1. 质粒型载体—环状dsDNA分子，自主复制 2. 病毒型载体—环状、线状、ss-和ds-DNA分子，形成病毒颗粒。噬菌体载体、植物病毒载体
3.混合型载体—具质粒和病毒特性，特性的转换依赖于宿主细胞生物学特性。柯斯质粒载体
质粒：存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的双链环状DNA分子。 质粒DNA的构型：1）SC型 共价闭合环形DNA 2）OC型 开环DNA（ocDNA 3）L 型 线性DNA（cDNA）
① 低拷贝数的质粒（1-4份拷贝），称为“严密型”复制控制的质粒；
高拷贝数的质粒（>10份拷贝)，称为“松弛型”复制控制的质粒 重组体质粒的转化存在三种可能性 (1)没有转化进宿主细胞
(2)质粒发生自身环化，没有重组成功（空载质粒） (3)重组成功（重组质粒 1. 标记基因的分类
1）选择标记基因：指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入宿主细胞，选择出成功转化载体的宿主。 Apr ，Tcr ，Kanr
2）筛选标记基因：指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子。 lacZ
β—半乳糖苷酶基因（lacZ ） α-互补： lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的 β-半乳糖苷酶的阴性突变体之间实现互补。
α-互补是基于在两个不同的缺陷 β-半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的；在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补。 α-互补筛选原理 1、在相应载体系统中，lacZ△M15放在F质粒上,随宿主传代；lacZ ’放在载体上,作为筛选标记。 2、IPTG: lac操纵子的诱导物;
X-gal：β-半乳糖苷酶的显色底物。
3、lacZ ’编码区上游插入小段 DNA片段， 51个bp的多克隆位点，不影响α-互补。
4、若在该多克隆位点中再插入一个大片段，导致α-互补失效。 X-gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷
β-半乳糖苷酶的显色底物。被β-半乳糖苷酶分解后产生蓝色产物，可使菌落或噬菌斑呈蓝色。
重组质粒，因互补作用遭到破坏，将显示白色菌落。 插入片段 无酶活性 白斑 未插入片段 有酶活性 蓝斑
克隆质粒载体按功能分，载体的分类—3类
1. 以扩增或保存DNA片段为目的的载体，通常称为克隆载体。
2. 第二类载体为表达载体。进行DNA重组的目的是要获得表达产物。
3. 第三类载体为穿梭载体，既能在真核细胞中繁殖，又能在原核细胞中繁殖。这类载体有真核细胞和原核细胞两种复制点。
克隆载体质粒必须具备的基本条件 (1) 具有复制起点 (2) 具有一个或多个选择标记基因 (3) 具有若干限制酶单一识别位点
(4) 具有较小的分子量和较高的拷贝数
用途: 基因组或cDNA文库的构建; 限制酶谱分析；外源DNA扩增。 例子: pBR322和pUC载体
pBR322的特性：较小的分子量，4363bp； 选择标记:Amp、Tet 筛选形式:抗性插入失活
?
? ? ?
a) b) c)
d) 较高拷贝数，氯霉素扩增，1000-3000个拷贝 e) 单一切点:24个
pBR322缺点：1、需要加入氯霉素来抑制蛋白质的合成，增加拷贝数。而现在常用的pUC质粒本身就含有一个改进的pMB1复制子并且具有很高的拷贝数。 2、没有多克隆位点。
3、相对现在的质粒分子质量较大。
4、检出有插入片段的重组克隆十分复杂。而pUC质粒使检出有插入片段的重组克隆成为一个但步骤程序。
? pUC载体是在pBR322质粒载体的基础上，组入了一个在其5′端带有一段多克隆位
点的lacZ′基因，而发展成为具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。 多克隆位点：MCS
? 表达载体将外源基因在宿主细胞中表达蛋白质的必要条件
1）需要很强的启动子，并能被宿主细胞的RNA聚合酶识别并启动转录。 2）需要很强的终止子，使RNA合成终止。rrnB 3）目的基因的编码区必须具有翻译起始密码子ATG，原核表达载体还需要SD序列。 大肠杆菌表达载体
? λ噬菌体，一种大肠杆菌双链DNA噬菌体。 ? 感染大肠杆菌的溶源性噬菌体，在感染宿主后可进入溶源状态，也可进入裂解循环。
? 噬菌体DNA的结构：在噬菌体颗粒内:
? 基因组DNA呈线性，其两端的5’末端各带有12个碱基的互补单链（粘性末端），
12个碱基的序列为5’GGGCGGCGACCT 3’。 当?噬菌体DNA进入宿主细胞后:
? 其两端互补单链通过碱基配对形成环状DNA分子，而后在宿主细胞的DNA连接酶
和旋促酶作用下，形成封闭的环状DNA分子，充当转录的模板。
. 电泳的基本原理：带电荷的分子在电场中会以一定的速率向与其电荷性质相反的电极移动，速度称为电泳迁移率。生理条件下，DNA、RNA带负电荷，在电场中会向正极方向迁移。
分子在电场中迁移的速度主要取决于大小和形状。
形状相似的分子的迁移速度主要与分子量相关: 分子量越大，移动越慢。
电泳的种类：琼脂糖凝胶电泳（大分子DNA）
聚丙烯酰胺凝胶电泳（小分子DNA，蛋白质）
获得目的基因的途径:.1 直接分离法 .2 PCR扩增 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种用引物和DNA聚合酶进行体外扩增特定的DNA序列的一种技术。 .3 构建基因组文库法 .4 构建cDNA文库法 .5 化学合成法 PCR反应过程:变性，退火，延伸
PCR反应体系：①模板：单链或双链DNA ②引物：16-30 bp合成的寡核苷酸 ③DNA聚合酶：耐热的DNA聚合酶 ④底物：四种脱氧三磷酸核苷（dNTP: dATP、dTTP、dCTP、dGTP) ⑤ 反应缓冲液：Mg2+、
某种生物的基因组的全部遗传信息通过克隆载体贮存在一个受体菌的群体之中，这个群体即为该生物的基因组文库
步骤：1采用限制酶切割 2构建基因组文库 3筛选目的基因克隆
目的基因与载体的连接 连接方式：1粘性末端连接 ，2平端连接 （T4 DNA连接酶催化平端连接） 3人工接头连接 4同聚物加尾连接
重组DNA导入受体细胞 转化:将重组质粒导入受体细菌细胞，使受体菌遗传性状发生
改变的方法。
感受态细胞: 受体细胞经过一些特殊方法的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许有外源DNA的载体分子通过的细胞。
方法： 化合物诱导转化法 磷酸钙沉淀法 电穿孔转化法 基因枪转化法 微注射技术法
? 重组子的筛选
1 根据载体表型特征 1）pBR322抗菌素标记选择：插入失活 2） pUC系列 ?-半乳糖苷酶显色反应选择法
2 根据插入序列的表型特征 1）弥补缺陷 转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。2) 利用报告基因筛选植物转化细胞 重组子的鉴定:
1根据重组DNA分子特征 1）直接凝胶电泳检测法 2）酶切电泳筛选法 3）PCR扩增检测法 4)DNA分子杂交检测法 2 根据目的基因转录产物(mRNA) 3 根据目的基因翻译产物
第三章 细胞工程
细胞工程的核心技术：细胞培养与繁殖 目的：获得新性状、新个体、新物质
细胞周期：指正常连续分裂的细胞从前一次分裂结束到下一次细胞分裂完成所经历的连续动态过程，所需的时间叫细胞周期时间。
定量描述液体培养基中细胞群体生长规律的实验曲线，称为生长曲线
典型生长曲线粗分为滞后期、指数生长期、稳定期和衰亡期等4个时期 。
细胞全能性定义 ：一个与合子具有相同遗传内容的体细胞具有产生完整生物个体的潜在能力。
合子：两性配子结合形成的新的细胞
植物细胞培养技术：在离体条件下，将愈伤组织等置于液体培养基中震荡培养，得到分散游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，从而获得大量细胞群体的一种技术。
愈伤组织：原指植物体受伤时产生于伤口周围的组织。现多指由外植体组织增生的细胞产生的一团不定型、疏散排列的薄壁细胞。
植物细胞培养方式 ：1 悬浮培养：分批培养、半连续培养、连续培养 2 固定化细胞培养
植物细胞悬浮培养是指使组织培养物分离成单细胞并不断扩增的液体培养技术 植物细胞悬浮培养流程 1）诱导产生愈伤组织
2）继代培养：愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织的松散性； 3）悬浮培养 ： 将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养物 4）过滤、离心，获得游离细胞 5）悬浮培养
悬浮培养的基本形式：分批培养 连续培养 半连续培养 分批培养含义：将细胞分散在一定容积的培养基中进行培养。
在培养过程中除了气体和挥发性代谢产物可以同外界空气交换外，一切都是密闭的。 它是进行细胞生长和细胞分裂的生理生化研究常用的培养方法。
? 继代最佳时期：对数生长期前期
植物细胞固定化培养定义：植物细胞固定在一种惰性基质上面或里面进行培养，细胞不能
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