Hydrolysis of concentrated raw starch: A new very efficient α-amylase from Anoxybacillus flavothermus
Carbohydrate Polymers， 2012，87,C46–52 Georges Tawil , Anders Viks?-Nielsen , Agnès Rolland-Sabaté , Paul Colonna , Alain Buléon等5人
浓缩原淀粉的水解:一种非常有效的耐热厌氧芽孢杆菌型α-淀粉酶
（食品科学与工程11-01班，牛云震译）
摘要：耐热厌氧芽孢杆菌中发现了一种新的α-淀粉酶（以下简称AFA），它能够 在生产葡萄糖浆的温度低于淀粉凝胶化温度时有效地水解原淀粉。AFA 是一种非常有效的,能够使一个31%的原淀粉悬架发生77%的水解。最后的水解程度能在2到3个小时内达到淀粉浓度低于15%并且在8到24小时内达到更高的程度。AFA在水解淀粉颗粒的结晶领域也非常有效。与被观察到的支链淀粉优先水解相一致。主要的a-型晶体结构比非晶域被分解的速度更快。而直链淀粉复合物在第二步骤中被降级。可伸缩的直链淀粉片段然后重新与b型晶体结构发生关系形成最终的耐α-淀粉酶片段。AFA的作用方式和限制完全水解的因素在细节上还需要讨论。
关键词: α-淀粉酶、玉米淀粉、结晶、脂质淀粉复合物、摩尔质量分布、耐药分数、低聚糖 1.引言
淀粉和它的两个主要成分,直链淀粉和支链淀粉,α-淀粉酶对其主要降解的部位是α(1,4)糖苷键。α-淀粉酶在发酵，萌发，消化等生物反应中是非常重要的,也广泛应用于如工业生产葡萄糖糖浆工业生产、面包产品的控制或保鲜去除淀粉为基础的污渍洗涤剂等。
由于在室温下天然淀粉不溶于水,很多淀粉酶的应用在高温高压下进行使得淀粉产生糊化。在凝胶化作用下,淀粉颗粒的粒状结构和分子(双螺旋线)序列淀粉颗粒被破坏。这种物理状态的变化对于增强了酶水解淀粉的敏感程度是广为人知的。
相比之下,固体淀粉的水解底物强烈取决于淀粉结构和淀粉酶来源。(Buleon, Colonna,Planchot, & Ball, 1998; Colonna, Leloup, & Buleon, 1992; Gallant,Bouchet, Buleon, & Perez, 1992; Gerard, Colonna, Buleon, &Planchot, 2001; Gernat, Radosta, Anger, & Damaschun, 1993; Oates,1997; Williamson, Belshaw, Self, Noel, Ring, Cairns, Morris, Clark& Parker, 1992).形态和颗粒的表面,直链淀粉含量、晶体结构或脂质淀粉酶复合物的存在被证明是淀粉颗粒水解的限制因素。
相比酸水解降解只适于降解部分非晶态部分淀粉颗粒、α -淀粉酶却可以溶解无定形和结晶领域两种淀粉颗粒(Colonna, Buleon, & Lemarie, 1988;Gerard et
al., 2001)。参与晶体结构特别是来自晶体和游离物中破坏的双重螺旋线微晶体 的水解的作用机制少有人知。由于双螺旋线太宽以至于不能到达α-淀粉酶的催化场所，(André, Buleon, Haser, & Tran, 1999),他们相互解开被推测发生在吸附 阶段。淀粉酶的吸附作用被发现是水解淀粉颗粒的一个先决条件,但它的存在可以被低聚糖如麦芽糖和麦芽三糖等抑制(Leloup, Colonna, & Ring, 1991).我们最 近研究一种高效的毛根酶类型α-淀粉酶真菌。(RA)能充分利用生物燃料产品、并且能优先降解玉米淀粉的结晶部分(Tawil, Viks?-Nielsen, Rolland-Sabaté, Colonna, & Buleon, 2011).对这种酶来说，直链淀粉较慢降解的原因归结于在第 一阶段水解的是脂质复合型直链淀粉,然后在最后阶段由于投放了淀粉酶，直链淀粉颗粒发生了重结晶。脂质型直链淀粉复合物丛已被证明是存在于谷物淀粉这自然含有脂质但在含有水的条件下热油脂中包着淀粉而形成。(Biliaderis, 1992;Buleon & Colonna, 2007; Le Bail, Bizot, Ollivon, Keller, Bourgaux,
& Buleon, 1999).在重链种类中,最常见的是通过直链淀粉与脂质络合构成，单一
螺旋线包装在一个由16个水分子细胞嵌入的斜方晶系的单位晶胞中(Rappenecker and Zugenmaier, 1981)。脂质直链淀粉复合物也被认为在谷物淀粉中比原生构造对淀粉分解有更多的抗性(Gernat et al., 1993; Tawil et al., 2011)然而,在淀粉酶过量时或者水解时间较长时水解也是能完成的 (Biliaderis & Galloway, 1989;Holm et al., 1983)。
在这项研究中,我们集中于一种新的来自耐热厌氧芽孢杆菌细菌性α-淀粉酶(AFA)，它被发现在浓缩原淀粉的水解中非常有效。这个细菌淀粉酶包含一个属于CBM20家族淀粉结合区并且已被评估用于低温葡萄糖浆的生产。与相比传统的高温 α -淀粉酶相比，在传统的液化过程中这种酶的使用需要的能源和水更少。。其作用方式故意与已被广泛用于消化的淀粉制品的研究和作为原淀粉的水解酶模型猪胰腺对比研究。AFA特异性通过检测在水解不同浓度的玉米淀粉淀粉结构尤其是形态、晶体结构和摩尔质量分布的演变进展。一个完整的水解作用的限制因素也被调查出来。
2.实验 2.1.材料 2.1.1.基板
普通玉米淀粉是来自于Cerestar公司(Cargill Vilvoorde,Belgium). 2.1.2.酶
来自丹麦诺维信公司的AFA的纯化制备(Viks?-Nielsen et al .,2006) 。结晶化和冷冻干燥的
猪胰腺 α -淀粉酶和蛋白酶K (from Tritirachium album) 从西格玛化工公司(St. Louis, MO)购买。其他试剂均为分析纯。 2.2.样品制备 2.2.1.酶
PPA在20mmol ?1 可溶性磷酸盐缓冲剂,pH值6.5 --7.0,
包含2mol ?1 氯化钠,0.25mmol ?1 氯化钙和0.2 g/ L叠氮化钠 。 在转速为4167×g的离心机作用下，取出上清液用于
蛋白质水解含量测定。AFA在乙酸钠缓冲溶液中溶解量为 4mg/ml。
浓度通过A280决定并且被估算使用纯化AFA的分子吸光度为2.728 ,即在280纳米光下
每mg/ml的AFA溶液的吸光度。 2.2.2.
酶活性的测定 酶
活性是根据Ceralpha方法测定的(mcclearly et al .,2002)。主要原理是在过量的α-葡糖苷酶的条件下用α-淀粉酶水解非还原性末端 对硝基苯麦芽庚糖苷(以下简称BPNPG7) 释放的反式硝基酚（PNP）的数量
由在400纳米的波长工作的分光光度计决定。一个单位的活动定义(U) 为在40摄氏度,pH值7的条件下，一分钟内释放 释放来自于BPNPG7的1 微摩尔的PNP
时所需的淀粉酶数量。AFA和PPA的比活性分别为
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