技术要点
1.2.3.
试剂的制备、材料的准备反应条件的选择操作的标准化
试剂及材料的准备
ELISA的主要试剂有1.固相的抗原或抗体2.酶标记的抗原或抗体3.与标记酶直接关联的酶反应底物
固相载体ＥＬＩＳＡ 反应中最常用的固相载体为聚苯乙烯材料，聚苯乙烯
具有较强的吸附蛋白质的性能。抗体或蛋白质抗原吸附其上后保留原来的免疫活性，聚苯乙烯为塑料，可制成各种形式。在ＥＬＩＳＡ测定过程中，它作为载体和容器，不参与化学反应。
抗原、抗体和其它生物分子通过多种机制吸附至载体表面，这包括通过疏水键、流水/离子键的被动吸附,通过引入其它活性基团如氨基和碳基的共价结合，以及通过表面改性后的亲水键结合。
?高结合力酶标板(High Binding ELISA Plate):
经表面处理后蛋白结合能力大大增强,可达到400-500ng IgG/cm2,主要结合的蛋白分子量>10kD.使用该类板可提供敏感性,并可相对减少包被蛋白的浓度和用量,不足之处为较易产生非特异性反应.抗原或抗体包被后,以非离子去污剂无法有效地封闭未结合的部位,需使用蛋白作为封闭剂.
酶标板
?中结合力酶标板(Medium Binding ELISA Plate):
经表面硫水键被动与蛋白结合,适合作为分子量>20kD的大分子蛋白的固相载体,其蛋白结合能力为200-300ng IgG/cm2.由于该类板所具的仅与大分子结合的特性,适用于作为未纯化抗体或抗原的固相载体,可降低潜在的非特异性交叉反应.该类板可以惰性蛋白或非离子去污剂作为封闭液. ?氨基化酶标板(AminatedELISA Plate):
经表面改性处理后拥有带正电荷的氨基,其疏水键由亲水键取代.该类酶标板适合作为小分子蛋白的固相载体.使用合适的缓冲液和pH值,其表面可通过离子键与带负电荷的小分子结合.由于其表面的亲水特性和可通过其它交联剂共价结合的能力,可用于固定溶于Triton-100、Tween20等去污剂的蛋白分子.该类板的缺陷为由于降低了疏水性,一部分蛋白分子无法结合;此外,其表面需有效的封闭.由于亲水和共价的表面特性,使用封闭液必须能够与非反应性氨基集团和所选择的交联剂中任何官能基团如succinimide、aldehyde和maleimide发生作用。
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