狼疮性肾炎患者肾组织中胎源性微嵌合体的表达及其临床
意义*
郑 怡1，2，张仕锵2，倪瑾瑶2，李慧敏2，马 骏2，黄朝兴3△，陈国荣2△，蔡国平2，4△
【摘 要】【摘要】目的:探讨胎源性微嵌合体（FMc）与狼疮性肾炎（LN）的相关性。方法 :收集生育过男胎的24例LN和24例肾小球轻微病变（GML）的女性患者肾活检组织 ，采用荧光原位杂交技术（FISH）检测细胞中的Y染色体 ，并收集患者孕育史、临床和实验室资料进行分析。结果 :在9例LN和3例GML的肾组织中发现Y染色体阳性嵌合细胞 ，两组发生率的差异有统计学意义（P＜0.05），但在LN组 ，嵌合细胞的出现与蛋白尿、血清肌酐、抗双链DNA抗体、抗核抗体、补体C3、C4水平及SLEDAI评分等之间均无相关（P ＞0.05）。结论:FMc在女性LN患者肾组织中的发生频率高于对照组GML患者 ，但FMc的存在很可能与LN的发病、疾病活动性和进展性无关。 【期刊名称】中国应用生理学杂志 【年(卷),期】2016(032)003 【总页数】5
【关键词】【关键词】狼疮性肾炎；微嵌合体 ；荧光原位杂交 【DOI】10.13459/j.cnki.cjap.2016.03.014
系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种表现有多系统损害的慢性自身免疫性疾病，好发于育龄期女性；狼疮性肾炎（lupus nephritis，LN）是其累及肾脏所引起的一种免疫复合物性肾炎，发病率高且难以治愈。SLE的病因及发病机制尚未明确。近年来有研究表明，微嵌合体
（microchimerism，Mc）在自身免疫性疾病的发病机制中起着一定的作用 ，包括SLE［1］。Mc是指在个体存在少量来自不同基因个体的细胞。妊娠是Mc最主要形成机制，妊娠期胎源性细胞通过胎盘屏障进入母体，使母体成为胎源性微嵌合体（fetal microchimerism，FMc）。此外，输血、骨髓和器官移植也可能导致Mc的产生。但对于Mc与SLE是否相关，以及Mc在SLE中的作用尚无一致结论［2］。本研究选择有孕育史的LN女性患者肾活检组织为研究对象，采用荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）检测FMc的发生率，探讨FMc与LN患者临床表现和实验室数据以及其妊娠史的联系，以期进一步阐述LN的发病机制，为LN的治疗提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 研究对象与分组
收集温州医科大学附属第一医院肾内科2010年1月至2014年4月肾穿刺活检女性狼疮性肾炎石蜡标本24例（年龄20～40岁，平均33.42岁）作为研究对象，女性肾小球轻微病变（glomerularminor lesion，GML）24例作为对照（年龄20～40岁，平均36.21岁）。研究对象均生育过男胎，且无输血史及骨髓或器官移植史（表1）。以男性肾脏组织作为阳性对照。SLE的诊断参照1997年美国风湿病学会修订的SLE诊断标准符合4条以上［3］。SLE活动指数（SLEDAI）评分判断SLE疾病活动性。根据2003年国际肾脏病病理协会（ISN/ RPS）有关LN病理分型标准分型［4］，诊断为LN IV型12例，LN V型2例，LN IV+V型6例，LN III型2例，LN V+III型2例。GML诊断参照1995年世界卫生组织（WHO）第2版肾小球疾病分类［5］。 1.2 主要试剂
Y染色体探针（CEPY）、DAPI、NP40、预处理剂（NaHCN）、胃蛋白酶均购自Abbott公司。 1.3 荧光原位杂交方法
1.3.1 FISH步骤 常规石蜡切片2μm，烤片、脱蜡、脱水。预处理剂80℃处理30min，再用0.5mg/ml胃蛋白酶37℃消化60min；经过75%、85%、95%和100%梯度乙醇脱水各5 min，室温风干；将10μl CEPY探针滴于切片上，加盖玻片，以封片胶固定；在原位杂交仪（STATSPIN公司）中经75℃变性5 min，37℃杂交16 h；杂交后先后于室温、72℃的0.3%NP 40中洗脱；风干后加10μl DAPI，与细胞核做对比染色。绿色荧光信号标记Y染色体，DAPI染细胞核为蓝色。在荧光显微镜（Olympus，BX51）下 ，选择适宜的滤光片通道观察不同颜色的信号。FMc为蓝色细胞核中，存在绿色信号。男性肾脏组织用不加Y染色体探针的缓冲液代替CEPY作为阴性对照。用CCD采集图像，并以Photoshop软件进行彩色合成。
1.3.2 结果判定 所有标本均由两名不知道临床资料的观察员独立评分，切片＞90%细胞核的含有荧光信号，边缘完整的核内有表示Y染色体的绿色信号，且绿色信号和男性肾脏阳性对照片上的绿色信号强度相等为阳性。 1.4 统计学处理
采用SPSS 19.0软件对结果进行统计处理。分类变量用χ2检验进行比较 ，连续变量用 t检验进行比较，非正态分布的连续变量采用Mann-Whitney U检验进行比较。
2 结果
2.1 Y染色体阳性细胞在LN中的阳性率
狼疮性肾炎患者肾组织中胎源性微嵌合体的表达及其临床意义
