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纸片扩散药敏试验的原理：将含药物的纸片贴在接种有待测菌的固体培养基上，通过药物在培养基上的扩散，观察是否出现抑菌环，推断是否抑制细菌的生长。药物扩散的距离越远，药物浓度越低抑菌能力越强，因此可根据抑菌环的大小，判定药物对细菌的抑制作用强弱。药敏试验根据美国临床标准委员会 (NCCLS) 推荐的 K–B 琼脂法进行。本实验通过纸片药敏试验法观察多酸化合物对细菌有无抑制作用，为试管二倍稀释法提供有效基础数据。
用无菌棉拭子蘸取已经校正的 0.5 麦氏比浊浓度的菌液，挤掉多余菌液。用棉拭子涂布整个 MH 培养基表面，每次将平板旋转 60°，涂抹三次，最后沿周边擦绕两圈，以保证菌液涂抹均匀。待平板上的水分被琼脂完全吸收后贴含药纸片。用无菌镊子取药敏纸片贴在平板表面，纸片一贴后不可再拿起。每个平板贴 5 张纸片，纸片间距不少于 24 mm，纸片中心距平皿边缘不少于 15 mm。在菌接种后 15 min内贴完纸片。将平板反转，37℃ 恒温孵育 18~24 h 后取出，用游标卡尺测量抑菌圈直径，由平板背面测量最接近的整数毫米数并记录，每个平板各设三个平行组平板，测量抑菌直径时，应取三个平板的平均值为最终结果。抑菌环边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。
每次药敏试验用大肠杆菌 ATCC25922 和金黄色葡萄球菌 ATCC25923 做质控。药敏判读标准根据 CLSI 标准 (2009 年) 所载受试药对质控菌的抑菌环直径范围作为实验质控标准（判读标准见表 5-2）[84]。
表5-2 纸片扩散法－用质控菌株抑菌环直径(mm)允许范围监测抗菌药物敏感性试验准确
性
Table 5-2 Disc diffusion test － according the admissible range of quality-control strain’s inhibition zone diameter to monitor the accuracy of antibiotics susceptibility test (mm) 抗菌 药物 KF AMP CIP NOR
纸片含药量（μg） 30 10 5 5
S ≥18 ≥17 ≥21 ≥17
I 15–17 14–16 16–20 13–16
抑菌环直径(mm) R ≤14 ≤13 ≤15 ≤12
大肠埃希菌ATCC25922 16–22 28–35 30–40 15–21
金黄色葡萄球菌ATCC25923 27–35 27–28 22–30 29–37
KF: 头孢噻吩；AMP: 氨苄西林；CIP: 环丙沙星；NOR: 诺氟沙星；S: 敏感；I: 中介；R: 耐药
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纸片法(KB)药敏实验原理及实际操作方法
