标准PCR实验方案及步骤
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PCR操作方法
标准聚合酶链式反应 (PCR) 设置包括四个步骤: 1. 向PCR管中添加所需的试剂或预混液和模板。 2. 混合并离心。
*添加矿物油可防止在无加热盖的热循环仪中蒸发。 3. 按照热循环仪和引物参数扩增。
4. 先后通过琼脂糖凝胶电泳和溴乙锭染色,评估扩增的DNA。
下面默克sigma-aldrich ?将详细介绍这些步骤以及对应的材料和试剂选择要点。以下为使用Taq DNA聚合酶进行的基本PCR方案。
试剂:PCR需要哪些试剂?
PCR所用的试剂 推荐产品
Taq DNA 聚合酶
根据用户的偏好选择Taq DNA聚合酶:(参见后文Taq聚合酶表。)
PCR级纯水 PCR试剂级水
稀释至工作浓度的引物 10 μM工作原液足以进行大多数分析。
寡核苷酸 定制寡核苷酸
待扩增的DNA 研究人员自备
专用移液器
热循环仪 各种多孔恒温槽尺寸或规格
无菌过滤器移液管吸头
无菌1.5 mL螺纹盖微量离心管
Corning?螺纹盖微量离心管
选择匹配热循环仪的形式:
PCR管或板
单个薄壁200 μL PCR管
200 μL联排管
多孔板和封板膜
dATP、dCTP、dGTP、dTTP各含10 mM的脱氧核苷酸混
dNTP混合液
合液
*readymixes 已含dNTPs
什么是TAQ聚合酶?
Taq DNA聚合酶是一种来自嗜热细菌栖热水生菌的热稳定酶。其在PCR 常用于扩增DNA片段。该酶是重组形式,在大肠杆菌中表达。它能够承受反复加热至95°C(PCR技术强制要求)而不会显著损失活性。通过SDS-PAGE测定,该酶约为94 kDa,没有可检测的核酸内切酶或核酸外切酶活性。它具有5'→3' DNA聚合酶活性以及5'→3'核酸外切酶活性。每批Taq DNA聚合酶都经过PCR扩增和双链测序测试。该酶以5单位/μL供应,并配有优化的10x反应缓冲液。
标准Taq DNA聚合酶
请根据下表选择适合您反应条件的Taq DNA聚合酶混合物。可选择有/无氯化镁(MgCl2)的透明或红色染料配方,预配制readymix,或包含缓冲液和dNTP的预混液。
含MgCl2 单装MgCl2 Readymix 不含染料的透明配方
含有红色染料,供直接上样到凝胶
不含染料的透明配方
含有红色染料,供直接上样到凝胶
不含染料的透明配方
来自栖来自栖热水生菌的
REDTaq? DNA聚合酶 (D4309)
Taq DNA聚合酶,不含
MgCl2 (D4545)
REDTaq? ReadyMix? PCR反应混合液
(R2523)
ReadyMix? Taq PCR反应混合液 (P4600)
热水生菌的Taq DNA聚合酶
(D1806)
单位定义:在74℃下,一单位可在30分钟内将10 nmol的总脱氧核糖核苷三磷酸酯结合到酸可沉淀的DNA中。 操作步骤:PCR步骤 Taq DNA聚合酶、模板DNA、引物和MgCl2浓度的最佳条件取决于所用的系统。可能有必要确定每个单独组分的最佳条件。对于Taq DNA 聚合酶、循环参数和MgCl2浓度尤其如此。建议滴定酶和MgCl2以确定最佳效率。 1. 按照表中给出的顺序将试剂添加到适当大小的试管中。(选择合适的反应设置表:标准试剂或预混试剂。)对于大规模反应,应设置不含模板的预混液,并将其等分到反应管中。最后,应将模板添加到适当的管中。
标准PCR反应
用量 组分 终浓度 w μL
水
5 μL
10x PCR缓冲液(P2192或P2317)*
1x
1 μL
脱氧核苷酸混合液
200 μM
w μL
正向引物
(通常长度为15-30个碱基)
0.1-0.5 μM
x μL
逆向引物
(通常长度为15-30个碱基)
0.1-0.5 μM
0.5 μL
Taq DNA 聚合酶* 0.05 单位/μL
y μL
模板DNA(通常为10 ng)
200 pg/μL
z μL
25 mM MgCl2(仅与缓冲液P2317一起使用)
0.1-0.5 mM
50 μL
总反应物体积
*可组合购买以下缓冲液和Taq 聚合酶:D1806、D4309或D4545 Readymix PCR反应 用量 组分 终浓度 25 μL
Readymix(R2523或P4600)
w μL
正向引物
(通常长度为15-30个碱基)
0.1-0.5 μM
x μL
逆向引物
(通常长度为15-30个碱基)
0.1-0.5 μM
y μL
模板DNA(通常为10 ng)
200 pg/μL
z μL
水
50 μL
总反应物体积
2.轻轻涡旋混合并短暂离心,收集试管底部的所有组分。
说明:如果使用没有加热盖的热循环仪,则向每个试管的顶部添加50 μL矿物油以防止蒸发。 3.扩增扩增参数会随所使用的引物和热循环仪的不同而不同。可能需要针对具体的引物、模板和热循环仪优化系统。
典型的循环参数
建议进行25-30个循环的扩增 PCR步骤 温度(°C) 时长 变性温度
94 °C 1 min
退火引物
55 °C 2 min
延伸
72 °C 3 min
4.扩增的DNA可以用琼脂糖凝胶电泳和随后的溴化乙锭染色来评估。 说明:可以通过单次氯仿提取(1:1)除去矿物油覆盖层,回收水相。 核酸电泳试剂 ? ?
琼脂糖(预制胶、粉末等形式)
缓冲液,例如MOPS-EDTA-乙酸钠,tris-acetate-EDTA (TAE) 或tris-borate-EDTA(TBE)
? ?
凝胶上样溶液和RNA上样缓冲液 电泳染料或染料,如溴化乙锭