仔猪大肠杆菌基因工程
疫苗
YKK standardization office【 YKK5AB- YKK08- YKK2C- YKK18】
仔猪大肠杆菌病基因工程灭活疫苗
（K88ac-ST1-LTB）
新生仔猪大肠杆菌病是由产肠毒素性大肠埃希氏菌(Enterotoxigenic E.coli，ETEC)引起的一种高度接触性、急性、致死性腹泻，特征是排黄色或黄白色稀粪。临床上以1～7日龄新生仔猪下痢为主要特征，其中1—3日龄最多见。个别耐过仔猪经较长时间才能正常生长，但病愈存活后其生长发育和生产性能指标受到严重影响。
大肠杆菌性腹泻在我国广泛流行，新生仔猪大肠杆菌性腹泻的发病率和死亡率在不同地区各有差异，发病率为5.69%～86.5%，死亡率为17.0%～73.0% 。本病是影响养猪业发展的主要疾病之一。
产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)有两类致病因子：一类为黏附素（或称定居因子，起吸附固定作用，主要分为K88、K99、987P、F41等，其中以K88为主。另一类为肠毒素(耐热性肠毒素ST和不耐热性肠毒素LT)，是直接导致腹泻的因子。细菌通过黏附素固定在肠黏膜表面，大量繁殖后产生ST与LT两种肠毒素，引起剧烈腹泻，脱水、酸中毒、低血钾等。
辽宁益康生物股份有限公司科研人员经过大量的流行病学调查，病原菌的分离鉴定，致病因子的研究，从细菌致病机理出发，成功地研发出免疫谱宽，免疫效果好，使用安全的仔猪大肠杆菌基因工程疫苗，从根本上解决了新生仔猪大肠杆菌性腹泻免疫预防这一难题，现将有关情况报告如下。
一、疫苗免疫机理
妊娠母猪临产前进行大肠杆菌基因工程灭活疫苗免疫接种，产生三种抗体（抗ST1抗体、抗LT抗体、抗K88抗体），仔猪出生后吮食初乳，获得母源抗体产生被动免疫，从而抵抗大肠杆菌在肠道定居增殖，有效中和肠毒素，获得保护力。
二、产品特点
1、具有良好的免疫原性。
针对致泻因子耐热肠毒素（ST）、不耐热肠毒素（LT）和主要黏附因子K88，采用基因工程技术构建的GE-3菌株，可以有效表达K88ac-ST1-LTB融合蛋白，并辅以氢氧化铝胶佐剂，在保留了K88ac和LTB良好免疫原性基础上，赋予了ST1免疫原性。 2、构建菌株优良稳定。
通过对菌株的安全性、有效性、菌种限定代次及保存条件、疫苗保存条件及保存期等试验，证实了该菌株是一株良好的疫苗候选株。 3、该疫苗生产工艺科学、质量稳定。
通过对菌株发酵培养的培养基、诱导剂及其诱导条件、通气量及菌液灭活等进行了筛选和优化，确定了工业化生产工艺，并通过安全性、效力检验等试验，批次间稳定。
4、 本疫苗安全性可靠、无毒副作用。
采用实验动物模型接种，田间与区域本动物接种等试验进行安全性评价，表明本疫苗无肠毒素活性、无致病性，妊娠母猪临床母猪全部存活，均无流产、死胎和胎儿畸形等现象，分娩正常，所产仔猪生长发育良好。 5、免疫效果确实。
经仔猪免疫保护试验证实，灭活疫苗免疫初产怀孕母猪两次，新生仔猪吮食一天初乳后，用大肠杆菌强毒 C83902（K88ac+、ST+和LT+）株攻击新生仔猪，均获得了较好的免疫保护：保护率为90~97.4%，比未免疫组高16.17% ，平均日增重提高40g 。
三、安全试验、效力试验及推广应用效果情况 1、安全试验
（1）倍量接种安全试验
于不同猪场随机选取妊娠母猪200头，于临产前15～20天，颈部肌肉注射本疫苗，每头10 mL，分两侧注射。所有免疫接种的妊娠母猪均无任何不良反应，也无流产、死胎和胎儿畸形等现象，妊娠母猪分娩正常，所产仔猪生长发育良好。 （2）田间扩大安全试验
采用5个批次疫苗，试验母猪分别于产前30~35 日和15~20 日各颈部肌肉注射疫苗5mL，观察至分娩。约35日观察期内，试验母猪的临床表现正常，没有出现精神沉郁、厌食或注射局部变化，体温正常。
5批疫苗使用的总体情况显示，疫苗免疫母猪所产仔猪健康，疫苗的使用对免疫猪的产仔率没有影响。5批疫苗共免疫母猪1299头，共产仔13627头，疫苗免疫母猪平均产仔 10.5头左右；对照组共设置母猪126头，共产仔1249头，对照母猪平均产仔9.9头左右。
2、效力试验 （1）免疫攻毒
表1 新生仔猪吮食初乳4 h后攻毒保护率对比 妊娠母猪每头第一次 第二次 仔猪出生后吮食初免疫剂量 免疫时间 免疫时间 乳4h后攻毒保护率 2.5 mL 5.0mL 产前30～35 产前15～20 d 83.9%（47/56） 95.8%（46/48） 疫苗 吃乳时间批号 （日） 组别 攻毒数量（头） 存活数量（头） 保护率/存活率（%）
1 7 200902 14 28 试验组 对照组 试验组 对照组 试验组 对照组 试验组 对照组 20 10 20 10 20 10 20 10 保护率对比
17 0 19 1 19 2 20 2 85 0 95 10 95 20 100 20 表2 不同哺乳时间仔猪攻毒
（2）田间免疫效果试验
在辽宁瑞嘉原种猪场进行的田间试验结果：试验组（免疫K88ac-ST1-LTB三价灭活疫苗）比对对照组（未免疫）保护率高38.22%，仔猪成活率高16.17%，平均日增重高0.08 Kg。表现出了明显的优势。
（3）区域免疫效果试验
于辽宁、河北、山东、黑龙江、吉林等地猪场随机选取妊娠母猪650头，于产前30～35 d和15～20 d，经颈部肌肉注射各免疫1次，每头5 mL。免疫母猪共产仔猪7156头，发生新生仔猪大肠杆菌性腹泻126头，发病率为1.76%，死亡21头，死亡率为0.29%，对照组发病率为40.29%(139/345)、死亡率为20.58%(71/345)，两组的发病率和死亡率均呈极显着差异(P<0.01)
3、推广应用情况
依据农业部批准《中华人民共和国农业部兽用生物制品临床试验批件，201002号》，于2010年02～11月在辽宁省黑山县、辽阳市、海城市、建平县、营口市5个猪场进行了区域性临床试验，试验情况如下。
仔猪大肠杆菌基因工程疫苗审批稿
