二羟丙茶碱与牛血清白蛋白的相互作用及共存金属离子的
影响
刘 里, 成飞翔
【摘 要】摘要：在优化的实验条件下,利用光谱法研究二羟丙茶碱(Di)和牛血清白蛋白(BSA)的相互作用和共存金属离子(Cu2+、Fe3+、Mn2+、Ni2+、Cr3+)对Di与BSA的相互作用的影响.结果表明:Di对BSA的荧光有猝灭作用,其猝灭过程属于静态猝灭.在290、305和320 K时分别计算结合常数、结合位点、Hill系数.根据热力学参数确定Di和BSA之间的作用力类型主要为氢键和范德华力.结合位点位于BSA的亚结构域ⅡA和ⅢA中,同步荧光光谱显示两者的结合位点更接近于色氨酸,同时研究了常见金属离子对二者作用的影响. 【期刊名称】四川师范大学学报（自然科学版） 【年(卷),期】2016(039)002 【总页数】6
【关键词】二羟丙茶碱; 相互作用; 金属离子; 荧光光谱; 紫外光谱
二羟丙茶碱(Diprophylline,简称Di)为头孢菌素衍生物,常用于治疗支气管哮喘、喘息型支气管炎、阻塞性肺气肿等,起缓解喘息症状作用,也可用于治疗心源性哮喘[1].以往国内外的研究都只是对其疗效进行分析[2-4],至今还没有用光谱法研究Di与BSA的结合特征的报道,而且以往研究药物与BSA结合作用主要集中在猝灭机理的判断上,而本文从多方面研究了Di与BSA的结合反应,除了常规的作用机理,还深入探讨了两者的结合位置、药物之间的协同性以及5种金属离子对Di与BSA结合反应的影响,这些研究对于阐明Di在机体内的传输、代谢过程及药理作用具有有益的参考意义.
1 实验部分
1.1 仪器与试剂 荧光光谱仪:F-4600,日本日立公司,狭缝宽度10.0 nm,负电压为400 V;紫外-可见光谱仪:Cary 50,美国瓦里安技术中国有限公司;精密酸度计:pHS-3C,上海虹益仪器仪表有限公司.牛血清白蛋白:上海楷样生物技术有限公司,配制1.0×10-5 mol·L-1的溶液;二羟丙茶碱:质量分数99%,阿拉丁-上海晶纯生化科技股份有限公司,配制0.007 mol·L-1的溶液;其他试剂都为分析纯,实验用水为超纯水.
1.2 实验方法 依次加入1.0×10-5 mol·L-1的BSA 1.75 mL,不同体积的7.0×10-3 mol·L-1的Di溶液,0.5 mol·L-1NaCl溶液2.0 mL,0.2 mol·L-1以及pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液1.0 mL于比色管中,定容至10 mL并混均.荧光分光光度计记录荧光光谱,其最大激发和发射波长(λex/λem)位于280 nm/345 nm处,记录F0和F(F和F0分别指Di存在与不存在时BSA的荧光强度).扫描同步荧光光谱(Δλ=15和60 nm);测定物质的浓度比为1∶1的BSA与Di溶液的紫外吸收光谱.
2 结果与讨论
2.1 体系条件的优化 分别考察缓冲溶液、pH、缓冲溶液的用量、BSA的浓度、试剂加入顺序以及反应时间对体系荧光强度的影响,结果表明,选用0.2 mol·L-1,pH=7.40的Tris-HCl缓冲溶液1.0 mL调节酸度,1.75×10-6 mol·L-1BSA作为反应浓度,BSA→Di→NaCl→Tris-HCl的加入顺序,放置15 min后进行测量效果最佳.
2.2 猝灭机理 由于BSA分子中存在着酪氨酸、色氨酸等能够发射荧光的芳香性氨基酸残基,所以它是一种典型的内源荧光物[5].用波长为280 nm的光进行激
发,BSA分子中色氨酸残基的荧光发射峰位于340 nm附近.从图1可知,随着PDS浓度的增加,BSA的荧光强度呈规律性降低,说明PDS对BSA的荧光有明显的猝灭作用(图1中1→12为c=(0、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4)×10-4 mol·L-1).
为了确认Di对BSA的猝灭机理,用S-V公式[6]:F0/F=1+KSVD=1+Kqτ0D,对在290 、305和320 K时荧光实验数据进行分析,KSV为猝灭常数;Kq为表观速率常数,τ0为荧光体平均寿命,一般为10-8 s数量级[7],D为Di的浓度.作F0/F-D图2并根据公式算出3个温度下的KSV和Kq列于表1.从表1很明显看出,反应温度越高,直线斜率即KSV越小,这与静态猝灭机理正好吻合[7].该体系的Kq的数量级为1012大于最大动态猝灭常数2.0×1010 L/(moL·s)[5],由此初步判断Di对BSA不是动态猝灭.
另一判断猝灭机理的方法是对比药品加入前后荧光体吸收光谱的改变[7].本实验测定了在优化条件下的Di(a)、BSA(d)以及Di-BSA(c)的紫外吸收光谱图(图3).图3为等浓度Di与BSA紫外吸收光谱的叠加线(b)和Di-BSA混合液的紫外吸收光谱(c)对比,2条谱线完全不同,说明Di的加入使BSA的紫外吸收光谱改变,生成了新的复合物,进一步证明荧光猝灭机理为静态猝灭. 静态猝灭过程,遵循L-B双倒数方程[8-10]: (F0-F)-1=F0-1+(KLBF0D-1),
其中KLB为解离常数.用(F0-F)-1对D-1作不同温度下的L-B曲线,如图2所示.图2中3个温度的直线斜率随着温度升高降低,这与静态猝灭机理是吻合的.由斜率和截距求得KLB,见表2.从表2可以看出,3个温度下的r都达到0.99以上,线性关系良好,其KLB值都在104数量级,结合较强,表明Di与BSA的结合是符
合静态猝灭的特征.
2.3 表观结合常数Kb以及结合位点数n 如药物小分子与生物大分子存在n个等同且独立的结合位点,它们之间相互作用关系符合双对数公式 lg [(F0-F)/F]=lg Kb+nlgD[10].
由lg [(F0-F)/F]对lg D作图3,由直线截距可得表观结合常数Kb,斜率可求n,计算结果见表3.由表3可看出,n对于温度比较敏感,随着温度升高,n由2减少到1,即表明Di与BSA可形成1～2个结合位点.Kb在104数量级上较大,表明Di与BSA之间有强的结合作用.
2.4 猝灭过程中热力学函数 当温度相差不大时,可以把焓变看成一个常数,由不同温度下的Kb,可根据热力学方程[11]算出反应焓变△H、自由能△G和熵变△S,计算结果见表4.由表4可知,Di与BSA的热力学参数△G<0,△H<0,△S<0表明Di与BSA为自发的放热反应.根据D. P. Ross等[12]总结出的判断规律,推断出Di与BSA的作用力以氢键和范德华力为主.
2.5 结合位置的确定 大多数药物在BSA上结合部位为亚结构域IIA(含有酪氨酸和色氨酸)和IIIA(含有酪氨酸).为确定Di与BSA结合的具体位置采用A. Sulkowska等[13]提出的对比λex=280 nm和λex=295 nm时的荧光光谱的方法[13-15].由图5可知,2种激发波长下,Di与BSA的猝灭曲线是交叉的并且几乎重叠,这一现象说明在Di与BSA的猝灭反应中,色氨酸和酪氨酸残基都参与其中,结合位点在亚结构域ⅡA和ⅢA中.
2.6 药物协同性 刘保生等[10]认为药物协同性是指药物与具有多重结合部位的BSA结合过程中各结合部位之间可能存在相互影响作用,可用Hill方程[13-15]进行分析:
lg H/(1-H)=lg K+nHlg D,
H为结合饱和分数,K为结合常数,nH为Hill系数.在荧光实验中 H/(1-H)=B/(Bm-B),
其中,B=(F0-F)/F0;1/Bm是1/B对1/[c]作图的截距.Di-BSA的nH值的计算结果见表5.表5表明,药物协同性对温度变化比较敏感,当温度小于305 K时,n<1,说明Di与BSA结合过程中,Di分子之间呈现出弱的负协同作用,即前一个药物分子结合到BSA位点上后,阻碍于后一个药物分子与BSA的结合.但当温度达到320 K,n>1,表现出较强的正协同作用,即前一个药物分子结合到BSA位点上后,非常有利于后一个药物分子与BSA的结合.
2.7 二羟丙茶碱对BSA构象的影响 基于△λ变化的同步荧光光谱法可被用于蛋白质构象的分析原理[7],固定BSA的浓度,逐渐增大Di的浓度,分别在△λ=15 nm和△λ=60 nm测得BSA中酪氨酸残基的同步荧光光谱(见图6A)和色氨酸残基的同步荧光光谱(见图6B).由图6可知,2种氨基酸残基的荧光强度都随Di的不断加入而产生猝灭,λem明显向长波移,酪氨酸残基λem红移了4.4 nm,色氨酸残基λem红移了2 nm,并且酪氨酸移动得更明显,猝灭程度也更大,表明Di的加入改变了2种氨基酸残基的微环境,原因可能是Di使BSA伸展,减少了氨基酸残基间的能量传递才导致荧光猝灭[9],Di与BSA的结合位点更加接近于酪氨酸残基(图6中cDi=(0、2、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2)×10-4 mol·L-1).
2.8 金属离子的影响 由于金属离子可与BSA相结合,所以药物与BSA结合过程中,血清中的金属离子产生了竞争作用,金属元素的存在会直接影响到药物与蛋白质的结合已有报道[10].本文考察了Fe3+、Mn2+、Cr2+、Ni2+和Cu2+对
二羟丙茶碱与牛血清白蛋白的相互作用及共存金属离子的影响
