人血浆非对称性二甲基精氨酸浓度的
RP-HPLC测定法
【摘要】 目的:建立一种测定人血浆中非对称性二甲基精氨酸（Asymmetric Dimethylarginine，ADMA）浓度的反相高效液相色谱法（RP-HPLC）。 方法 :采用 Waters symmetry C18柱（5μm，3.90 mm×150 mm），以0.05 mmol/L乙酸钠（pH6.8）为流动相A，甲醇为流动相B，线性梯度洗脱：14% 15 min，31% 25 min，45% 5 min（V/V/V），流速1.0 ml/min，荧光检测，激发波长330 nm，发射波长450 nm，邻苯二甲醛（OPA）进行柱前衍生，室温下检测。结果:ADMA在0.05～5μg/ml范围内有良好线性关系，最小检出量为
0.05μg/ml，平均相对回收率为（93.76±2.57）%，日内、日间平均变异系数分别为(3.25±1.59)%、(4.60±1.37)%。结论:本方法准确、简便、快速，适用于 科学 研究 和临床检测。
【关键词】 非对称性二甲基精氨酸 色谱法 反相高效液相
血浆中非对称性二甲基精氨酸(Asymmetrical dimethylarginine，ADMA)浓度变化与心血管疾病发生 发展 密切相关，近年来研究显示ADMA升高是一种新的心血管病危险因素[1]。关于血浆中ADMA浓度的检测方法，国外虽已有报道[2，3]，但操作繁琐，干扰因素多。国内曾有采用正相色谱法的报道[4]。本研究在国内外同类研究的基础上适当改进，采用反相色谱法，用一元线性梯度洗脱，建立一套准确、简便、快速的高效液相色谱法检测人血浆中ADMA浓度的方法，报告如下。 1 材料
1.1 试剂 AMDA标准品、衍生剂OPA、3-巯基丙酸均购自Sigma公司，HPLC 分析 纯度>99.99%；甲醇为一级色谱纯，购自天津市四友生物医药 科技 有限公司；硼酸为一级色谱纯，购自上海试剂总厂；乙酸钠、冰乙酸、氢氧化钾、5-磺基水杨酸为分析纯，购自上海试剂总厂。 超纯水（18.25 MΩ·cm）。 1.2 仪器与设备 高效液相色谱仪为Agilent1100系列，包括G1322在线脱气机、G1311A四元泵、G1316A柱温箱、G1321A FLD荧光检测器；自动进样器；Agilent化学工作站（RevA.08.03.[847]）。 高速离心机（TGL-16G，上海安亭科学仪器厂出品）；漩涡混合器（XW-80A,上海医科大学仪器厂生产）； 电子 分析天平（AB204-A，上海梅特勒-托利多仪器公司灵敏度0.1 mg）；超纯水制备机（杭州永洁达净化科技有限公司生产）。
1.3 AMDA工作液配制 准确称取ADMA标准品10 mg于100 ml容量瓶中，用超纯水溶解并定容，得浓度为100μg/ml ADMA储备液。再用超纯水依次稀释为1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml的ADMA工作液，贮存于4 ℃备用。
1.4 流动相A配制 精密称取乙酸钠4.1 g，用重蒸水溶解后，在1000 ml容量瓶中定容，用2 mol/L冰乙酸调节pH值到6.8，即得浓度为0.05μmol/L，pH6.8的乙酸钠溶液，然后用0.45μm 滤膜过滤，超声脱气。
1.5 OPA衍生剂配制 精确称取OPA 20 mg，加400μl的甲醇，0.2 mol/L硼酸3.6 ml（pH=9.5），3-巯基丙酸20μl，混匀避光（现配，现用）。
2 方法和结果
2.1 色谱条件 色谱柱：Waters Symmetry C18柱（5μm，3.9 mm×150 mm），保护柱：Waters Symmetry C18 保护柱（5μm，3.9 mm×20 mm）；流动相：A为0.05μmmol/L乙酸钠（pH6.8），B为甲醇，按B 14% 15 min，31% 25 min，45% 5 min（V/V/V）梯度洗脱；进样量20μl；流速1.0 ml/min；柱温40 ℃；荧光检测波长：激发波长330 nm，发射波长450 nm。
2.2 血浆样品处理 方法 于1.5 ml离心管（EP管）中精密加入待测血浆1.0 ml，加入20 mg 5-磺基水杨酸，漩涡混匀5 min，冰浴15 min，于12000 r/min 离心10 min，吸取上清液。
2.3 样本柱前衍生 取“2.1”中上清液100μl，加OPA衍生剂100μl，漩涡混匀避光2 min后，上机，自动进样检测，色谱图见图1，可见血浆中ADMA峰形良好，分离完全，无杂质峰干扰。
2.4 标准曲线的制备 于7支1.5 ml离心管中依次加入不同量的不同浓度的AMDA工作液，再各加入人空白血浆，配成终浓度依次为0.05μg/ml、
0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml、2.0μg/ml、5.0μg/ml的血浆标准品溶液系列。 再按血浆样本处理方法处理后分别测定，并记录色谱图，以峰面积为纵坐标，ADMA浓度为横坐标进行线性回归，得直线回归方程
Area=60.90027848×Amt+3.5852958，r=0.99973，最小检出量0.05μg/ml，其含量在0.05～5.0μg/ml之间有良好的线性关系。
2.5 精密度试验 按“2.3”项分别配制浓度为0.1μg/ml、0.2μg/ml、
0.5μg/ml的血浆标准品溶液。按血浆样本处理方法处理后，日内衍生5次，隔日再衍生5次，分别 计算 日内变异和日间变异。结果见表1。
2.6 回收率试验（相对回收率） 按“2.3”项分别配制浓度为0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.5μg/ml的血浆标准品溶液。再按血浆样本处理方法处理后测其浓度，以实测浓度与配制浓度之比乘以100%计算ADMA的相对回收率，重复试验5次。结果见表2。 3 讨论
本 研究 方法在国内外同类研究的基础上进行了适当改进，采用线性梯度洗脱。线性梯度洗脱能缩短 分析 时间，提高分离度，改善峰形，提高检测灵敏度等。本研究中ADMA出峰干净，形态良好、对称，但出峰时间较其他 文献 报道[3,4]却有所延长。这同血浆样本处理方式有很大的关系，国外同类研究对血浆样本采用固相萃取分离，因此出峰可不考虑血浆中其他杂质 影响 ，而国内同类研究受实验条件的限制，对血浆样本仅采用血浆蛋白沉淀法，因此需排除血浆中其他杂质的影响。本研究采用5-磺基水杨酸血浆蛋白沉淀法，血浆蛋白沉淀较完全，但一开始杂质峰仍较多，因此采用线性梯度洗脱，调整出峰时间至19～20 min，以减少杂质峰的干扰，结果显示ADMA目标峰出峰良好，形态对称。
本研究建立的血浆ADMA浓度RP-HPLC检测方法，采用OPA柱前衍生、线性梯度洗脱，具有快速、简便、色谱峰形佳，结果准确可靠等优点，血浆中ADMA最低检测浓度为0.05μg/ml，精密度和相对回收率均符合生物等效性指导原则的要求，而文献报道称健康人血浆ADMA水平是(1±0.1)μmol/L
（0.275±0.028μg/ml）[5]，因此本方法适用于科研试验研究和临床检测。 【 参考 文献】
[1]Schnabel R, Blankenberg S, Lubos E,et al. Asymmetric
dimethylarginine and the risk of cardiovascular events and death in patients with coronary artery disease: results from the AtheroGene Study [J]. Circ Res,2005,97(5):e53-e59.
[2] Teerlink T, Nijveldt RJ, de Jong S, et al. Determination of
arginine, asymmetric dimethylarginine, and symmetric dimethylarginine in human plasma and other biological samples by high-performance liquid chromatography [J]. Anal Biochem,2002 ,303(2):131-137.
[3] Teerlink T.Determination of the endogenous nitric oxide synthase inhibitor asymmetric dimethylarginine in biological samples by HPLC[M]. Methods Mol Med,2005,108:263-274.
[4] 张润香,李菊香,熊玉卿,等. HPLC测定人血浆中不对称性二甲基精氨酸浓度 [J].江西医学院学报,2003,43(4):19-21.
[5] Boger RH. The emerging role of asymmetric dimethylarginine as a novel cardiovascular risk factor [J].Circ Res, 2003, 59 (4): 824-833.
人血浆非对称性二甲基精氨酸浓度的RP-HPLC测定法重点
