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实验 蛋白质的基本性质
实验一 蛋白质的沉淀、变性反应 实验二 蛋白质和氨基酸的颜色反应 实验一 蛋白质的沉淀、变性反应
一、目的和要求
1．了解蛋白质的沉淀反应、变性作用和凝固作用的原理及它们的相互关系。 2．学习盐析等生物化学操作技术。
二、基本原理
蛋白质分子在水溶液中，由于其表面形成了水化层和双电层而成为稳定的胶体颗粒，所以蛋白质溶液和其他亲水胶体溶液相似。但是，在一定的物理化学因素影响下，由于蛋白质胶体颗粒的稳定条件被破坏，如失去电荷、脱水，甚至变性，而以固态形式从溶液中析出，这个过程称为蛋白质的沉淀反应。这种反应可分为可逆沉淀反应和不可逆沉淀反应两种类型。
可逆沉淀反应——蛋白质虽已沉淀析出，但它的分子内部结构并未发生显著变化，如果把引起沉淀的因素去除后，沉淀的蛋白质能重新溶于原来的溶剂中，并保持其原有的天然结构和性质。利用蛋白质的盐析作用和等电点作用，以及在低温下，乙醇、丙酮短时间对蛋白质的作用等所产生的蛋白质沉淀都属于这一类沉淀反应。
不可逆沉淀反应——蛋白质发生沉淀时，其分子内部结构空间构象遭到破坏，蛋白质分子由规则性的结构变为无秩序的伸展肽链，使原有的天然性质丧失，这时蛋白质已发生变性。这种变性蛋白质的沉淀已不能再溶解于原来溶剂中。
引起蛋白质变性的因素有重金属盐、植物碱试剂、强酸、强碱、有机溶剂等化学因素，加热、振荡、超声波、紫外线、X-射线等物理因素。它们都能因破坏了蛋白质的氢键、离子键等次级键而使蛋白质发生不可逆沉淀反应。
天然蛋白质变性后，变性蛋白质分子互相凝聚或互相穿插缠绕在一起的现象称为蛋白质的凝固。凝固作用分两个阶段：首先是变性，其次是失去规律性的肽链聚集缠绕在一起而凝固或结絮。几乎所有的蛋白质都会因加热变性而凝固，变成不可逆的不溶状态。
三、材料与试剂
1.实验材料：鸡蛋或鸭蛋。 2．实验试剂：
(1)蛋白质溶液：取5mL鸡或鸭蛋清，用蒸馏水稀释至l00mL，搅拌均匀后用4~8层纱布过滤，新鲜配制。
(2)蛋白质氯化钠溶液：取20mL蛋清，加蒸馏水200mL和饱和氯化钠溶液l00mL，充分搅匀后，以纱布滤去不溶物(加入氯化钠的目的是溶解球蛋白)。 (3)其他试剂
①硫酸铵粉末 ②饱和硫酸铵溶液 ③0.5％乙酸铅溶液 ④10％三氯乙酸溶液 ⑤浓盐酸 ⑥浓硫酸 ⑦浓硝酸 ⑧ 0.1%硫酸铜溶液 ⑨饱和硫酸铜溶液 ⑩
1110％乙酸溶液 ○12饱和氯化钠溶液 ○1310%氢氧化钠溶液 ○140.1%乙酸溶液 ○
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95％乙醇
四、实验器材
①试管及试管架 ②小玻璃漏斗 ③滤纸 ④玻璃棒 ⑤烧杯 ⑥量筒 ⑦100℃恒温水浴箱
五、操作方法
1．蛋白质的盐析作用
用大量中性盐使蛋白质从溶液中沉淀析出的过程称为蛋白质的盐析作用。蛋白质是亲水胶体，蛋白质溶液在高浓度中性盐的影响下，蛋白质分子被中性盐脱去水化层，同时所带的电荷被中和，结果蛋白质的胶体稳定性遭到破坏而沉淀析出。析出的蛋白质仍保持其天然性质，当降低盐的浓度时，还能溶解。因此，蛋白质的盐析作用是可逆过程。
沉淀不同的蛋白质所需中性盐的浓度不同；而沉淀相同的蛋白质，因使用中性盐类不同所需的盐浓度也有差异。例如，向含有清蛋白和球蛋白的鸡蛋清溶液中加硫酸镁或氯化钠至饱和，则球蛋白沉淀析出；加硫酸铵至饱和，则清蛋白沉淀析出。另外，在等电点时，清蛋白可被饱和硫酸镁或氯化钠或半饱和的硫酸铵溶液沉淀析出。所以在不同条件下，用不同浓度的盐类可将各种蛋白质从混合溶液中分别沉淀析出，该法称为蛋白质的分级盐析，并在提纯蛋白质时常被应用。
取一支试管，加入3mL蛋白质氯化钠溶液和3mL饱和硫酸铵溶液，混匀，静置约10min，则球蛋白沉淀析出，过滤后向滤液中加入硫酸铵粉末，边加边用玻璃棒搅拌，直至粉末不再溶解，达到饱和为止，此时析出的沉淀为清蛋白。静置，倒去上部清液，取出部分清蛋白沉淀，加水稀释，观察它是否溶解。
2．重金属盐沉淀蛋白质
重金属盐类易与蛋白质结合成稳定的沉淀而析出。蛋白质在水溶液中是酸碱两性电解质，在碱性溶液中(对蛋白质的等电点而言)，蛋白质分子带负电荷，能与带正电荷的金属离子结合成蛋白质盐，当加入汞、铅、铜、银等重金属的盐时，蛋白质形成不溶性的盐类而沉淀，并且这种蛋白质沉淀不再溶解于水中，说明它已发生了变性。
重金属盐类沉淀蛋白质的反应通常很完全，因此在生化分析中，常用重金属盐除去体液中的蛋白质；在临床上用蛋白质解除重金屑盐的食物性中毒。但应注意，使用乙酸铅或硫酸铜沉淀蛋白质时，试剂不可加过量，否则可使沉淀出的蛋白质重新溶解。
取3支试管，各加入约1ml蛋白质溶液，分别加入0.5％乙酸铅溶液1～3滴和0.1％硫酸铜溶液3~4滴，观察沉淀的生成。向第一、二支试管再分别加入过量的乙醋铅和饱和硫酸铜溶液，观察沉淀的再溶解。
3．无机酸沉淀蛋白质
浓无机酸(除磷酸外)都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。这种沉淀作用可能是蛋白质颗粒脱水的结果。过量的无机酸(硝酸除外)可使沉淀出的蛋白质重新溶解。临床诊断上，常利用硝酸沉淀蛋白质的反应，检查尿中蛋白质的存在。
取3支试管，分别加入浓盐酸15滴，浓硫酸、浓硝酸各10滴。小心地向3支试管中，沿管壁加入蛋白质溶液6滴，不要摇动，观察各管内两液面处有白色环状蛋白质沉淀出现。然后，摇动每个试管，蛋白质沉淀应在过量的盐酸及硫酸中溶解。在含硝酸的试管中，虽经振荡，蛋白质沉淀也不溶解。
4．有机酸沉淀蛋白质
有机酸能沉淀蛋白质。在酸性溶液中(对蛋白质的等电点而言)，蛋白质分子带正电荷，能与带负电荷的酸根结合。生成不溶性蛋白质盐复合物而沉淀。三氯乙酸和磺基水杨酸是沉
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淀蛋白质最有效的两种有机酸。
取一支试管，加入蛋白质溶液约0.5mL，然后滴加10％三氯乙酸溶液数滴，观察蛋白质的沉淀。
5．有机溶剂沉淀蛋白质
乙醇、丙酮都是脱水剂，它能破坏蛋白质胶体颗粒的水化层，而使蛋白质沉淀。低温时，用乙醇(或丙酮)短时间对蛋白质的作用，还可保持蛋白质原有的生物活性；但用乙醇进行较长时间的脱水可使蛋白质变性沉淀。
取一支试管，加入蛋白质氯化钠溶液1ml再加入95％乙醇2ml并混匀，观察蛋白质的沉淀。
6．加热沉淀蛋白质
蛋白质可因加热变性沉淀而凝固，然而盐浓度和氢离子浓度对蛋白质加热凝固有着重要影响。少量盐类能促进蛋白质的加热凝固；当蛋白质处于等电点时，加热凝固最完全、最迅速；在酸性或碱性溶液中，蛋白质分子带有正电荷或负电荷，虽加热蛋白质也不会凝固；若同时有足量的中性盐存在，则蛋白质可因加热而凝固。
取5支试管，编号，按表2加入有关试剂。
表2 (单位：滴)
试剂 管号 1 2 3 4 5 蛋白质溶液 10 10 10 10 10 0.1％乙酸溶液 - 5 - - - 10％乙酸溶液 - - 5 5 - 饱和NaCl溶液 - - - 2 - 10%NaOH溶液 - - - - 2 蒸馏水 7 2 2 - 5 将各管混匀，观察、记录各管现象后，放入100℃恒温水浴中保温10min．注意观察、比较管的沉淀情况。然后，将第3，4，5号管分别用10％NaOH溶液或10％乙酸溶液中和，观察并解释实验结果。
将第3，4，5号管继续分别加入过量的酸或碱，观察它们发生的现象。然后，用过量的酸或碱中和第3，5号管，100℃水浴保温10min，观察沉淀变化，检查这种沉淀是否溶于过量的酸或碱中，并解释实验结果。
思考题
1．在蛋白质可逆沉淀反应实验中，为何要用蛋白质氯化钠溶液? 2．高浓度的硫酸铵对蛋白质溶解度有何影响，为什么?
3．蛋白质分子中的哪些基团可以与重金属离子作用而使蛋白质沉淀? 4．鸡蛋清为什么可用作铅中毒或汞中毒的解毒剂?
5．蛋白质分子中的哪些基团可以与有机酸、无机酸作用而使蛋白质沉淀? 6．在加热沉淀蛋白质的实验过程中应注意哪些问题?
实验二 蛋白质与氨基酸的颜色反应
一、实验原理
1．蛋白质和氨基酸鉴定的常用方法原理
蛋白质所含有的某些氨基酸及其特殊结构，能够与某些试剂反应，生成有
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实验蛋白质基本性质(编)
