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文件编号：73021
微生物限度检查方法及其验证报告
目 录
1 样品相关信息 1.1 基本信息
2 主要仪器设备和试验耗材信息 2.1 主要使用的仪器设备 2.2 试验用培养基 2.3 试验用试剂 2.4 试验用菌种 3 试验环境 3.1 无菌室 3.2 洁净工作台 3.3 生物安全柜 4 试验方案 4.1 验证试验目的
4.2 微生物限度检查方法草案 5 方法验证试验 5.1 菌液制备
5.2 计数培养基适用性检查 5.3 控制菌检查用培养基使用性检查 5.4 供试液制备 5.5 方法验证
5.5.1 菌落计数方法验证试验 5.5.2 控制菌检查方法的验证 5.6 方法验证结论
6 供试品微生物限度检查结果 1 样品相关信息 1.1 基本信息（三批）
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品名 规格 批号 多烯酸乙酯软胶囊 或 蛹油α-亚麻酸乙酯胶丸 0.25g/粒，30粒/瓶 或0.3g/粒，30粒/瓶 2 主要仪器设备和试验耗材信息 2.1 主要使用的仪器设备
仪器名称 型号 HH·BⅡ·360 MJX-150 培养箱 SPX-150B JJ-5 电子天平 超净工作台 生物安全柜 2.2 试验用培养基 2.2.1 对照培养基
培养基名称 胰酪大豆胨琼脂培养基 胰酪大豆胨液体培养基 沙氏葡萄糖琼脂培养基 沙氏葡萄糖液体培养基 麦康凯液体培养基 麦康凯琼脂培养基 RV沙门增菌液体培养基 2.2.2 试验用培养基
培养基名称 胰酪大豆胨琼脂培养基 胰酪大豆胨液体培养基 沙氏葡萄糖琼脂培养基 沙氏葡萄糖液体培养基 编号 ZL-025 ZL-042 ZL-046 ZL-026 ZL-013 ZL-028 ZL-029 JY1001 JH-DCB BSC-1100ⅡA2 批号 生产厂家 中国食品药品检定研究院 配制批号 页眉内容
麦康凯液体培养基 麦康凯琼脂培养基 RV沙门增菌液体培养基 2.3 试验用试剂
试剂名称 配制批号 含1%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 含0.05%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 0.9%氯化钠 1%红四氮唑 2.4 试验用菌种
菌种名称 大肠埃希菌 枯草芽孢杆菌 金黄色葡糖球菌 乙型副伤寒沙门菌 白色念珠菌 黑曲霉 3 试验环境
《中国药典》2015版规定，微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。
本公司微生物限度室、阳性对照室、生物安全柜及超净工作台洁净度检测无特殊情况下每季度进行一次。 3.1 无菌室
无菌室按《医药工业洁净厂房设计规范》GB 50457-2008监测，静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对10000级洁净度要求。 3.2 超净工作台
超净工作台按《医药工业洁净厂房设计规范》GB50457-2008监测，静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对100级洁净度要求。
超净工作台沉降菌检测记录
菌种编号 CMCC（B）44 102 CMCC（B）63 501 CMCC（B）26 003 CMCC（B）50094 CMCC（F）98 001 CMCC（F）98 003 工作用菌种批号及代数信息 E3-02 E3-02 E3-02 E3-02 E3-02 E3-02 页眉内容
沉降菌落数 3.3生物安全柜
左 0 中 0 右 0 空白对照 0 生物安全柜按《生物安全实验室建筑技术规范》GB50346-2011监测，静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对100级洁净度要求。 生物安全柜沉降菌监测记录 沉降菌落数 4 试验方案
按《中国药典》2015年版第四部：（通则1105）非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法、（通则1106）非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法、（通则1107）非无菌药品微生物限度标准及（通则1121）抑菌效力检查法规定，本品微生物限度标准为：1g供试品中，需氧菌总数不得过1000cfu，霉菌和酵母菌总数不得过100cfu，大肠埃希菌不得检出。 4.1 验证试验目的
确认所采用的方法适合于本品的微生物限度检查。即确认本品在该检查量
及该检验条件下无抑菌活性或其抑菌活性已被充分消除到可以忽略不计。保证检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。 4.2 微生物限度检查方案
对三批产品进行3次独立的平行试验。 取本品10g，加含1%聚山梨酯80 的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，振摇至供试品分散均匀，制成1： 10的供试液。取1：10的供试液1ml，加含1%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化 钠-蛋白胨缓冲液至9ml，即为1：100的供试液。微生物计数法，取1：10的供 试液1ml，注入平皿中，依法检查（中国药典2015年版四部通则1105）；控制菌 检查法，取1：10的供试液10ml，置胰酪大豆胨液体培养基100ml中，依法检 查（中国药典2015年版四部通则1106）。 5 方法验证试验
对上述非无菌产品微生物限度检查方法方案进行验证。 5.1 菌液制备
左 0 中 0 右 0 空白对照 0 页眉内容
（1）接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、沙门菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，30～35℃培养18～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中，20～25℃培养2～3天。上述培养物用H7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。
（2）接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20～25℃培养5～7天，加入3ml 0.05%聚山梨酯80的 H7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，过滤菌丝吸出孢子悬液至无菌试管内，用0.05%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。 5.2 计数培养基适用性检查 （实验时间：
取上述制备好的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌菌液各1ml（小于100cfu），分别注入无菌平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平板，混匀，凝固，置30～35℃培养3～5天，计数；取上述制备好的白色念珠菌、黑曲霉菌液各1ml（小于100cfu），分别注入无菌平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平板，混匀，凝固，置20～25℃培养5～7天，计数；同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落平均数的70%，且菌落形态大小与对照培养基的菌落一致，判该培养基的适用性检查符合规定。试验结果如表1：
表1 培养基适用性检查结果 金黄色葡萄球枯草芽孢大肠埃希菌 杆菌 菌 对照培1 养基 2 平均 被检培1 养基 2 平均 回收率% 菌落形态大小 是否一致 黑曲霉 白色念珠菌
微生物限度检查方法及其验证报告(修改)
