课后限时集训40 基因工程
1．科学工作者将某种海蜇的DNA分子上一段长度为5 170个碱基对的片段——绿色荧光蛋白基因，转入到夹竹桃细胞中，培育出一种夜间发光的夹竹桃。培育过程如图所示，回答有关问题。
(1)构建图中的重组Ti质粒，还需用到的基因工程基本工具是____________________。作为受体农杆菌应________________，以方便筛选已导入重组Ti质粒的受体农杆菌。在将重组Ti质粒转入农杆菌之前，先要用Ca__________________细胞。
(2)图中将绿色荧光蛋白基因导入夹竹桃细胞的方法称为______________。转基因夹竹桃幼苗对青霉素__________(填“具有”或“不具有”)抗性，原因是______________________________________。
(3)绿色荧光蛋白基因含有____________，因此在农杆菌细胞中不能正常表达，而在夹竹桃细胞中能正常表达。
[解析] (1)构建图中的重组Ti质粒，还需用到的基因工程基本工具是限制性核酸内切酶(或限制酶)、DNA连接酶。由于Ti质粒上含有抗青霉素基因，故作为受体农杆菌应不含抗青霉素基因(或对青霉素敏感)，以便根据质粒上的标记基因筛选导入重组质粒的农杆菌。在将重组Ti质粒转入农杆菌之前，先要用Ca处理农杆菌，其目的是使其成为感受态细胞，易于吸收周围环境中的外源DNA分子。
(2)图示中将绿色荧光蛋白基因导入夹竹桃细胞的方法称为农杆菌转化法。根据图示可知目的基因插入在了质粒上的T-DNA片段，由于T-DNA可转移至受体细胞并且整合到受体细胞的染色体DNA上，所以插入在T-DNA中的目的基因被导入夹竹桃细胞并整合到了染色体DNA上，而抗青霉素基因没有进入夹竹桃细胞，故转基因夹竹桃幼苗对青霉素不具有抗性。
(3)绿色荧光蛋白基因来自真核生物，含有内含子，转录后需要将内含子转录的部分在细胞核进行剪切，而农杆菌为原核生物，不具备该剪切功能，因此在农杆菌细胞中不能正常表达，而在夹竹桃细胞中能正常表达。
[答案] (1)限制性核酸内切酶(或限制酶)、DNA连接酶 不含有抗青霉素基因(或对青霉素敏感) 感受态 (2)农杆菌转化法 不具有 农杆菌(或重组Ti质粒)中只有T-DNA才能进入夹竹桃细胞，而抗青霉素基因没有进入夹竹桃细胞 (3)内含子
2．几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程
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处理农杆菌，其目的是使其成为
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将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题：
(1)在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是__________________。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是_________________。
(2)以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是_______________________。
(3)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是__________________________________(答出两点即可)。
(4)当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是____________________________________________________。
(5)若获得的转基因植株(几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中)抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是______________。
(6)目前关于转基因生物安全性的争论主要集中在________安全、________安全和________安全三个方面，而这三个方面的争论发生的原因主要还是因为转基因生物的特性及其对现存生物和自然环境的影响具有很大的不确定性。例如，由于________________________________________，因此在转基因生物中，有时候会出现一些人们意想不到的后果。
[解析] (1)与老叶相比，嫩叶组织细胞易破碎，容易提取到几丁质酶的mRNA。提取RNA时，提取液中添加RNA酶抑制剂可防止RNA被RNA酶催化降解。
(2)以mRNA为模板，按照碱基互补配对原则，在逆转录酶的作用下，通过逆转录(反转录)可以获得cDNA。
(3)因该目的基因是通过逆转录形成的，无表达所需的启动子，也无在受体细胞内进行复制所需的复制原点等，所以在受体细胞内不能稳定存在和表达，也不能遗传下去。
(4)构建基因表达载体时，DNA连接酶能催化目的基因和质粒载体这两个DNA片段之间形成磷酸二酯键。
(5)转基因植株的基因组中含有几丁质酶基因，但该植株抗真菌的能力并没有提高，可能是由于转录或翻译异常，即几丁质酶基因未能正常表达。
(6)目前关于转基因生物安全性的争论主要集中在食物安全、生物安全和环境安全三个方面。由于外源基因插入宿主基因组的部位往往是随机的，加之转移的基因不少都是异种生物的基因，因此在转基因生物中，有时候会出现一些人们意想不到的后果。
[答案] (1)嫩叶组织细胞易破碎 防止RNA降解 (2)在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA (3)目的基因无复制原点；目的基因无表达所需启动子 (4)磷酸二酯键 (5)目的基因的转录或翻译异常 (6)食物 生物 环境 外源基因插入宿主基因组的部位往往是随机的(转移的基因不少都是异种生物的基因)
3．(2024·安徽省宣城市高三期末)烟草是有重要经济价值的双子叶植物，易受TMV(烟
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草花叶病毒)感染而大幅度减产。绞股蓝细胞中含有抗TMV基因，能抵抗TMⅤ感染。研究人员利用转基因技术培育出了抗TMⅤ烟草，操作流程如图所示。
(1)①表示遗传信息流动中的________过程，所需原料为________。过程③所需要的工具酶是________________________________________。
(2)大量扩增目的基因可以使用PCR技术，该技术包括变性、退火、延伸三个步骤，变性这一步骤的目的是____________________________。
(3)过程④最常用的方法是________，过程⑤用到的细胞工程技术是______________________________。
(4)过程⑥还需要进行基因工程操作步骤中的________________，其中，在个体水平上检验获得的烟草能否抗TMV的方法是_____________。
[解析] (1)①表示以RNA为模板逆转录形成DNA的过程，所需原料为DNA的单体：4种脱氧核苷酸。过程③构建基因表达载体的过程需要用同种限制酶切割目的基因与运载体，用相同的DNA连接酶连接目的基因与运载体的末端。
(2)PCR技术中的变性是利用高温使DNA发生变性，解旋形成单链。
(3)过程④将目的基因导入植物体细胞的方法常用农杆菌转化法，过程⑤受体细胞通过植物组织培养技术得到再生植株。
(4)过程⑥从再生植株中筛选成功转基因的抗TMV烟草植株还需要进行基因工程操作步骤中的目的基因的检测与鉴定；其中，若从个体水平鉴定获得的烟草能否抗TMV，可通过接种烟草花叶病毒的方法来确定。
[答案] (1)逆转录 四种脱氧核苷酸 限制酶和DNA连接酶 (2)使DNA解旋为单链(DNA解旋) (3)农杆菌转化法 植物组织培养 (4)目的基因的检测与鉴定 用TMV感染烟草，观察烟草是否被感染(患病)
4．国际水稻研究所人员从产量低的耐淹水稻中找到一种耐淹基因，将其移入到高产热带水稻中，终于培育出耐淹的高产水稻品系，其产量比高产热带水稻产量还要高。耐淹基因移入的方法可通过转基因技术实现。请回答下列相关问题：
(1)为培育耐淹的高产水稻品系，应需将耐淹基因进行体外扩增。在PCR反应体系中加入了热稳定DNA聚合酶、引物等，还加入耐淹基因作为________，加入__________________________________作为合成DNA的原料。
(2)质粒常被用作运载体，因为质粒具有__________________(答2点即可)。构建耐淹基因的质粒表达载体时，常用不同的限制酶对耐淹基因和质粒进行切割，目的是________________________________________________________。
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(3)根据耐淹基因表达的蛋白质，研究人员通过对它的氨基酸序列设计并人工合成耐淹基因。与水稻的耐淹基因相比，人工合成的耐淹基因在结构上缺少了__________________________________。虽然两种基因转录的产物不同，但最终表达出相同的蛋白质，可能原因是_____________。
(4)蛋白质工程中，要对蛋白质结构进行设计改造，必须通过基因修饰或基因合成来完成，而不直接改造蛋白质的原因是____________。
[解析] (1)利用PCR技术在体外扩增耐淹基因(目的基因)时，在PCR反应体系中除了加入热稳定DNA聚合酶、引物等外，还加入耐淹基因作为模板，加入dNTP(dATP、dTTP、dGTP、dCTP)作为合成DNA的原料。
(2)质粒被用作运载体，应具备的条件有：能在宿主细胞内复制并稳定存在；具有多个限制酶切位点，方便剪切；具有标记基因，便于检测和筛选。构建耐淹基因的质粒表达载体时，用不同的限制酶对耐淹基因和质粒进行切割，可以减少耐淹基因及质粒的自身环化、使耐淹基因定向连接到质粒上，以增大耐淹基因正向(正确)连接的概率。
(3)根据耐淹基因表达的蛋白质的氨基酸序列推测出的mRNA分子中，缺乏与基因中的启动子、终止子和内含子相对应的碱基序列。由于密码子具有简并性，虽然两种基因转录的产物不同，但最终能够表达出相同的蛋白质。
(4)由于直接改造的蛋白质不能遗传，而改造基因易于操作且改造后能够遗传，所以在蛋白质工程中，要对蛋白质结构进行设计改造，必须通过基因修饰或基因合成来完成，而不直接改造蛋白质。
[答案] (1)模板 dNTP(dATP、dTTP、dGTP、dCTP) (2)能在宿主细胞内复制并稳定存在；具有多个限制酶切位点，方便剪切；具有标记基因，便于检测和筛选(答2点即可) 减少耐淹基因及质粒的自身环化、增大耐淹基因正向(正确)连接的概率 (3)启动子、终止子和内含子 密码子具有简并性 (4)改造基因易于操作且改造后能够遗传
5．(2024·广东省实验中学高三联考)CRISPR/Cas9系统基因编辑技术是近年来颇受关注的一项新技术。该基因表达系统主要包含引导RNA和Cas9蛋白两个部分，引导RNA能识别并结合特定的DNA序列，从而引导Cas9蛋白结合到相应位置并剪切DNA，最终实现对靶基因序列的编辑。研究人员试图用CRISPR/Cas9系统对水稻产量基因Q基因进行编辑，请回答下列问题：
(1)研究发现，CRISPR/Cas9仅存在于原核生物，故需借助________技术才能在水稻细胞中发挥作用。Cas9蛋白与________酶的功能相似。
(2)首先依据________的部分序列设计DNA片段A(负责编码相应引导RNA)，再将片段A与含有Cas9基因的质粒B连接，以构建编辑水稻Q基因的CRISPR/Cas9系统基因表达载体(如图所示)。位点Ⅰ、位点Ⅱ分别表示________酶切位点。
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(3)质粒B大小为2.5 kb(位点Ⅰ与位点Ⅱ相隔60 b)，经酶切后的片段A大小为0.5 kb(千碱基对)，连接形成的表达载体大小为________kb。
(4)常用农杆菌转化法将目的基因导入水稻受体细胞，依据农杆菌的侵染特点，目的基因将插入到Ti质粒的__________上，经过转化作用，进入水稻细胞，并将其插入到________________________________，从而使其得以维持稳定和表达。
(5)CRISRP/Cas9基因编辑技术有时存在编辑对象出错而造成脱靶，试从引导RNA的角度分析脱靶的原因____________________________________。
[解析] (1)根据题干信息“Cas9蛋白结合到相应位置并剪切DNA”，说明Cas9蛋白与限制酶的功能相似。
(2)由于是对水稻产量基因Q基因进行编辑，故首先需要依据Q基因的部分序列设计DNA片段A(负责编码相应引导RNA)，再将片段A与含有Cas9基因的质粒B连接，以构建编辑水稻Q基因的CRISPR/Cas9系统基因表达载体(如图所示)。根据片段A两端的限制酶种类以及片段A连接在位点Ⅰ、位点Ⅱ之间，可知位点Ⅰ、位点Ⅱ分别表示KpnⅠ和BamHⅠ的酶切位点。
(3)质粒B大小为2.5kb(位点Ⅰ与位点Ⅱ相隔60 b)，经酶切后的片段A大小为0.5 kb(千碱基对)，连接形成的表达载体大小为2.5＋0.5－0.06＝2.94 (kb)。
(4)常用农杆菌转化法将目的基因导入水稻受体细胞，由于农杆菌的Ti质粒的T-DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上，故可将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，经过转化作用，进入水稻细胞，并将其插入到水稻细胞染色体的DNA上，从而使其得以维持稳定和表达。
(5)由于其他DNA序列也含有与引导RNA互补配对的序列，造成引导RNA错误结合，从而导致CRISRP/Cas9基因编辑技术会出现编辑对象出错而造成脱靶。
[答案] (1)转基因(DNA重组或基因工程) 限制 (2)Q基因 KpnⅠ、BamHⅠ (3)2.94 (4)T-DNA 水稻细胞染色体的DNA上 (5)其他DNA序列也含有与引导RNA互补配对的序列，造成引导RNA错误结合而脱靶
6．(2024·河南顶级名校高三联考)为探究M基因的功能，科研人员将克隆得到的M基因导入拟南芥植株(自交繁殖)，流程图如图所示，回答下列问题：
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2024版高考生物一轮复习 课后限时集训40 基因工程 苏教版
