黑暗胁迫下拟南芥叶片衰老突变体的筛选及鉴定

黑暗胁迫下拟南芥叶片衰老突变体的筛选及鉴定

祁 蒙，贾 敏，刘夏燕

【摘 要】摘要:叶片衰老作为叶片发育的最后阶段，是营养物质从叶片到其他器官的重新配置过程，对植物的适应环境至关重要。衰老突变体及衰老相关基因的鉴定，对在分子水平上理解叶片衰老具有重要意义。本研究以拟南芥野生型为植物材料，通过EMS诱变技术构建突变体库，并建立了合理的黑暗胁迫体系诱导叶片衰老。利用该系统筛选到1个衰老表型加剧的衰老异常突变体accelerated senescence in dark1－1(asd1－1)。通过黑暗胁迫条件下对该突变体的叶绿素含量分析及叶片总蛋白含量的测定，确定了该突变体确实为叶片衰老加剧突变体，为寻找新的叶片衰老调控基因及揭示植物衰老途径的分子机制提供依据。

【期刊名称】江苏农业科学 【年(卷),期】2018(046)018 【总页数】6

【关键词】关键词:叶片衰老;黑暗胁迫;拟南芥;突变体筛选 基金项目:陕西省自然科学基金(编号:2015JM3081)。

植物衰老是一个年龄依赖的在细胞、组织、器官和生物体水平上的程序性死亡过程，是生长发育的最后一个阶段［1－2］。叶片衰老作为植物衰老的主要形式，是叶片细胞对年龄信息及一系列内外环境的总体响应。影响叶片衰老的环境因子包括生物因素及非生物因素，生物因素包括病菌入侵或邻近植物遮蔽等，非生物因素包括干旱、营养限制、黑暗处理、极端温度及氧化胁迫等［3－4］。而外界因素的影响，会导致衰老的提前发生［5－6］，例如，黑暗是最有效也

是最简便的诱发衰老的信号，使植物产生快速、一致的衰老表型［7］。在衰老过程中，伴随着叶片形态上的显著变化如叶色逐渐黄化，细胞内也发生一系列的生理生化反应［8－9］。首先，生长及环境因素等信号分子激活调控衰老相关基因表达的转录因子［10－11］，从而启动相关基因的表达。随后，细胞内的各组分开始进入有序的降解过程，其中叶绿体的降解最早发生;伴随着叶绿体的降解就是叶绿素和蛋白质的降解，典型的叶绿体蛋白如核酮糖二磷酸羧化酶及叶绿素结合蛋白(CAB)等都有很大程度的减少;其他组分如膜脂、核酸等也被一定程度的降解，降解后的小分子营养物质被转移到新生器官或种子中循环利用［12－13］。叶片衰老是植物进化选择的产物，能够帮助植物更好地适应环境并保证后代的繁衍［14］，但另一方面，叶片衰老降低了作物产量和生物量的积累，限制了水果、蔬菜以及观赏植物的寿命，使植物更容易受到病原体侵害［15－16］。因而，对叶片衰老的研究一方面可以更深入地阐明衰老过程的分子机理;另一方面，对提高作物产量及果蔬储藏具有重要经济意义。

目前研究衰老机制主要从遗传筛选和分子手段两方面入手。遗传手段包括筛选和鉴定衰老异常突变体。拟南芥作为模式植物，具有全基因组已经测序、生长周期短、叶片生长发育阶段易于区分等特点，成为研究叶片衰老的最适材料［1，4］。拟南芥突变体的获得主要有物理诱变、化学诱变、T－DNA插入诱变等［17］。化学诱变法作为经典的诱变方法，其产生的突变体为基因功能研究提供了丰富资源。甲基磺酸乙酯(EMS)是一种较为常用的化学诱变剂，能诱发植物产生高密度的系列等位基因点突变，并且诱变频率高、副作用(致死或不育等)较小、操作简单［18］，因而被广泛用于拟南芥的诱变处理。对经过诱变处理后的植物，通常多利用植物表型鉴定、生理生化、遗传学等方法进行筛选。

本研究先对野生型拟南芥进行时间梯度的黑暗胁迫诱导，获得一个合理的诱导衰老体系:将拟南芥种子在添加1%蔗糖的MS培养基上持续光照生长7 d，之后移栽至不添加外源糖的MS培养基上，并进行梯度黑暗胁迫处理，植物叶片随处理时间延长呈现出明显的衰老表型;接着，将自噬基因突变体在碳素缺乏条件下，经过黑暗诱导后呈现的早衰表型来确定试验体系的可行性和有效性;最后，以EMS诱变获得的M2代分离群体为研究对象，进行上述黑暗胁迫体系的诱导，从而筛选出可能的叶片衰老提前或者衰老延缓的突变体，成功获得了1个衰老提前的突变体asd1－1，进一步对该衰老异常突变体进行了鉴定和研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 拟南芥(Arabidopsis thaliana)野生型为Columbia(Col－0)生态型。植物经典自噬基因突变体atg5－1、atg7－3由笔者所在实验室购于拟南芥资源中心(Arabidopsis biological resource center，ABRC)。 突 变 体asd1－1为野生型拟南芥通过EMS诱变筛选得到。

1.1.2 主要试剂 拟南芥培养基质购自Pindstrup Substrate Peat Moss;蔗糖和 EMS购自美国 Amresco公司，琼脂(BACTO)购自美国BD公司。

1.1.3 溶液 种子漂洗液(50%市售 84消毒液，0.1%Triton X－100);MS全素固体培养基［5 mmol/L硝酸钾，2 mmol/L硫酸镁，2.5 mmol/L磷酸二氢钾，2 mmol/L硝酸钙，0.05 mmol/L Fe － EDTA，0.1% 微量元素混合液(V/V)，0.02%EMS，1%蔗糖，1%琼脂;KOH 调 pH 值为 5.8，121 ℃高压灭菌20 min］。 1.2 方法