专业： 农业资源与环境 姓名： 李佳怡
实验报告
学号： 3130100246 日期： 2015.6.9 地点： 生物实验中心310
课程名称： 生物化学实验（丙） 指导老师： 方祥年 成绩：__________________
实验名称： 质粒DNA的微量制备及电泳检测 同组学生姓名： 金宇尊、鲍其琛 一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填） 三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填） 五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得
一、实验目的和要求
1、学习并掌握质粒DNA的提取原理和方法； 2、了解琼脂糖凝胶电泳检测核酸的原理和操作；
装 3、学习并掌握对电泳检测结果的初步分析。
订 二、实验内容和原理
1、实验内容 ①质粒DNA的提取
②DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定 2、实验原理 ①质粒：
质粒是一种染色体（核质体）外的寄生性的自主复制子，存在于细菌等细胞中，为双链闭环的DNA分子，大小在1-200kb之间，具有自主复制和转录功能, 能表达例如抗性、菌毒素等细胞非必需的遗传信息，但其复制和转录必须要利用依赖宿主细胞（细菌）基因组DNA编码的一些酶和蛋白质。质粒能够自发的或人为的在细胞间转移，因此是基因工程技术中将外源基因导入受体细胞的重要载体。 ②从细菌细胞中抽提质粒DNA的步骤： a细菌培养使质粒大量扩增；
b收集和裂解细胞,并去掉细菌碎片和核质体DNA ；
c进一步除去蛋白、脂类、RNA等杂质，分离和纯化质粒DNA。 ③碱裂解法来分离纯化质粒DNA：
在EDTA存在下，经过SDS处理使细胞膜裂解，从而使菌体充分裂解，利用在碱性条件下（NaOH），使核质体DNA与质粒DNA的变性；加入乙酸钾，在中性条件下，核质体DNA与质粒DNA又存在复性的差异，质粒DNA很快得以复性，而细菌核质体DNA分子难以复性，核质体DNA会缠绕附着在细
线 胞膜碎片上通过离心被沉淀下来，质粒DNA则留在上清液内；上清液中还含有可溶性蛋白质、核糖核蛋白和少量核质体DNA以及脂质类杂质等，可通过碱性酚-氯仿-异戊醇混合液的抽提去除；含有质粒DNA的上清液用无水乙醇或异戊醇沉淀，这是由于当加入无水乙醇时，其会夺去核酸周围的水分子，使其失水而易于聚合。一般用2倍体积的乙醇或1倍体积的异丙醇沉淀DNA和RNA。获得较纯的质粒DNA。
④DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定:
DNA分子在琼脂糖凝胶中有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在碱性溶液中（pH8.3缓冲液）带负电荷，它在电场作用下向正极泳动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即具有不同的相对分子量的DNA片段泳动速度不同，并能区分出不同的区带。DNA片断在凝胶中当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭（EB）染色后，在紫外光下可见橙红色带，并可确定DNA片断在凝胶中的位置。
⑤影响DNA泳动速率（迁移率）的因素有：
DNA分子质量的影响：双链DNA分子迁移的速率与DNA分子量对数成反比。分子量越大，迁移率越小。
DNA构型的影响：超螺旋DNA＞线状DNA＞开环DNA。
胶浓度的影响： 浓度越低，相同核酸分子迁移越快，一般常用的凝胶浓度为1％～2％； 电场强度的影响：电场强度愈大，带点颗粒的泳动越快。但凝胶的有效分离范围随着电压增大而减小，所以电泳时一般采用低电压，（一般5V/cm）（电场强度） 。而对于大片段电泳，甚至用0.5～1.0V/cm电泳过夜。进行高压电泳时，只能使用聚丙烯酰胺凝胶。
EB的影响：溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加。
电泳缓冲液的影响:核酸电泳常采用TAE、TBE、TPE三种缓冲系统，但它们各有利弊。TAE价格低廉，但缓冲能力低，必须进行两极缓冲液的循环。TPE在进行DNA回收时，会使DNA污染磷酸盐，影响后续反应。所以多采用TBE缓冲液。在缓冲液中加入EDTA，可以鳌合二价离子，抑制DNase，保护DNA。缓冲液pH常偏碱性或中性，此时核酸分子带负电，向正极移动。
碱基组成与电泳温度的影响: 一般影响不大。 ⑥质粒DNA不同构型在琼脂糖凝胶电泳中的迁移速度： 环形双链DNA分子有三种构型。
第一种是共价闭合环状DNA，它的两条链都保持完整的环状结构，通常呈超螺旋构型，迁移速度最快；
第二种是开环DNA，它的双链中的一条保持完整的环状结构，另一条单链上有一到几个切口两条
核苷酸链中只有一条保持完整的环形结构，即OC构型，迁移速度最慢； 第三种是线状DNA，这种质粒的双链断裂呈线状,通称L构型。
这三种构型的同一种质粒在琼脂糖凝胶中电泳时，出现不同的迁移速率，走得最快的是超螺旋构型，其次是线性构型，最慢的是开环构型。 ⑦实验有关试剂的作用：
溶液Ⅰ：葡萄糖：增加溶液的黏度，减少抽提过程中的机械剪切作用，防止破坏质粒DNA。EDTA：络合掉Mg等二价离子，防止DNA酶对质粒分子的降解作用。Tris·HCl：使溶菌液维持溶菌作用的最适pH范围。
溶液Ⅱ：SDS：解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性。NaOH：破坏氢键，使DNA分子变性。 溶液Ⅲ：中和溶液Ⅱ的碱性，使染色体DNA复性而发生缠绕，并使质粒DNA复性。高盐的3mol/L NaAc/KAc有利于变性的大分子核质体DNA以及K/Na离子会与SDS形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去。
酚：一种强烈的蛋白质变性剂，能非常有效地去除蛋白质，同时抑制了核酸酶的降解作用。 氯仿：有强烈的溶脂倾向，可以溶解细胞膜，同时溶解去除脂质类杂质，此外具有使蛋白质变性并分相的作用。
异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。
乙醇或异丙醇——可以沉淀核酸，当加入乙醇时，其会夺去核酸周围的水分子，使其失水而易于聚合。一般用2倍体积的乙醇或1倍体积的异丙醇沉淀DNA和RNA。
70％的乙醇——用于洗涤核酸沉淀，其目的是去除盐及挥发性较小的异丙醇。 RNaseA——用于消化质粒DNA溶液中的残余RNA。
三、实验材料与试剂
1、实验材料 含重组质粒菌种 2、实验试剂
⑴ LB液体培养基 ⑵ 氨苄青霉素：100mg/ml ⑶ 溶液Ⅰ ⑷ 溶液Ⅱ ⑸ 溶液Ⅲ ⑹ 酚：氯仿：异戊醇（25：24：1） ⑺ 无水乙醇 ⑻ 70%乙醇 ⑼ TE缓冲液（pH 8.0） ⑽ RNaseA（1mg/ml） ⑾ 0.5×TBE缓冲液（pH8.0） ⑿ 琼脂糖 ⒀ 6×加样缓冲液 ⒁ 1mg/ml溴化乙锭（EB）
四、实验器材与仪器
1、恒温培养箱 37℃； 2、恒温摇床 37℃； 3、高压灭菌锅； 4、超净工作台； 5、台式离心机； 6、振荡器； 7、微量移液枪(10，20，200，1000ul)； 8、枪头（10，20，1000ul）及枪头盒；
9、离心管 1.5ml及离心管架； 10、制冰机； 11、冰箱； 12、干式恒温器 37℃、50℃ ； 13、微波炉； 14、电泳仪及； 15、电泳槽； 16、紫外检测仪。
五、实验操作方法和步骤
1、收集细菌,碱裂解液提取质粒DNA，纯化质粒DNA ①去除核DNA，粗提取质粒DNA
离心：取1.2ml的过夜培养菌液加入1.5ml离心管中，8000r/min离心1min；弃上清液， 将管倒置于吸水纸上，使液体尽可能流尽。
冰浴：将菌体沉淀加100ul溶液Ⅰ，振荡悬浮菌体，冰浴放置5～10min。
再离心：加200ul溶液Ⅱ，盖紧管盖，快速温和颠倒离心管数次，确保离心管内溶液混匀 使之变清，冰浴10min。加150ul溶液Ⅲ，盖紧管口，颠倒数次使之混匀，冰浴 放置5min。（说明：以上步骤目的） ②去除可溶性杂蛋白等杂质，纯化质粒DNA
离心：12000r/min离心10min，将上清液转至另一干净离心管，加入等体积的酚：氯仿： 异戊醇（25：24：1），振荡混匀，12000r/min离心 10min 。
冰浴：上清液移入另一干净离心管中，加入2倍体积无水乙醇，混匀后置-20℃冰箱中20min。 离心：12000r/min离心10min，弃上清液，将溶液管口倒置吸水纸上，使液体尽可能流尽。 ③去除核RNA
加样：加入1ml 70﹪乙醇洗沉淀一次（动作要轻），弃70﹪乙醇溶液，将管口倒置于吸水 纸上，使液体尽可能流尽，自然干燥或50℃干燥。
保存：将沉淀溶于50ul TE缓冲液（pH8.0，含20mg/L RNaseA）中，置37℃恒温器中保温 30min后，取质粒DNA样液做琼脂糖凝胶电泳鉴定，其余纯化的质粒DNA样品置于 -20℃保存备用。 2、DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定
①加样：取5ul纯化的质粒DNA样品，与1ul 6×电泳加样缓冲液混匀，用微量移液枪小心 加入样品槽中。若DNA含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过 样品槽容量。
（注：a勿划破或戳穿加样孔，勿带入气泡；b上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样 品槽底部凝胶刺穿；c每加完一个样品要换枪头以防互相污染。）
②电泳：加完样后，盖上电泳槽盖，立即接通电源，使电压调到100V，恒压电泳。当溴酚蓝 条带移动到距凝胶前缘约2cm时，停止电泳（约需30～60min）。
③观察和拍照：取出胶块置于紫外灯下观察，DNA存在处可显示出肉眼可辨的橘红色荧光带， 再用成像仪进行拍照，以便于分析。
注：紫外光对眼睛有害，观察时戴上防护镜或眼镜，或隔着玻璃或有机玻璃观察。
六、实验数据记录和处理
1、样品离心后：上层淡黄色，下层有乳黄色沉淀； 2、加入溶液Ⅰ后：沉淀溶解，溶液呈淡黄色； 3、加入溶液Ⅱ后：溶液无色澄清； 4、冰浴后：部分凝固，呈现无色； 5、加入溶液Ⅲ后：有白色絮状沉淀出现；
6、离心后：溶液分层，沉淀白色，有部分粉末悬浮；
7、加 酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）后：分层，下层颜色土黄色，上层淡黄色； 8、离心后：分层，上层无色透明，下层淡黄色，中层杂蛋白油状。
七、实验结果与分析
电泳图谱：
1、实验结果：
①第一条带对应的DNA为超螺旋构型DNA，条带最亮，表明此结构的DNA含量最高，同时其迁移距离最远，在同样时间内，超螺旋构型DNA迁移速度最快，结果正常。 ②第二条带对应的DNA为线状DNA，在三条带中颜色最浅，含量最少。
③第三条带对应的DNA，为开环DNA，迁移速度最慢，含量较线状DNA微多一些。 ④点样孔处有较多DNA残留，表明加样时有较多溢出，操作不够规范，仍需改进。 ⑤在第一条带之前无其它可辨的条带，可推测无RNA残留。 2、结果分析：
根据实验结果得出如下分析：①在加样时，未控制好位置和高度，导致残留在点样孔中的样品较多，因此也影响了各个条带中的样品量，若在加样时操作规范，则可增大条带中DNA的量。②各个条带之间距离较大，表明超螺旋构型DNA、线状DNA、开环DNA三种不同类型的DNA之间分离较好，且超螺旋型DNA亮度最亮，表明其含量最多。③但仍存在较多开环和线状DNA含量也较多，表明提取到的DNA杂质较多，原因可能为没有在洗涤沉淀时进行充分洗涤，只是稍微放置一会后就将乙醇倒掉了，应多放置一段时间，并微微摇动，以除去杂质。④由于在第一条带之上不再有其它可辨的条带，可推测无RNA残留。说明DNA纯度高，提取过程对RNA的去除完全。
八、讨论、心得
思考题：
1、在提取质粒DNA的过程中， EDTA、 SDS、 NaOH、乙酸钾、酚-氯仿-异戊醇等试剂的作用是什么？ EDTA：络合掉Mg等二价离子，防止DNA酶对质粒分子的降解作用。
SDS：：解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性。 NaOH：破坏氢键，使DNA分子变性。 乙酸钾：质粒DNA复性。
酚-氯仿-异戊醇：酚：一种强烈的蛋白质变性剂，能非常有效地去除蛋白质，同时抑制了核酸酶的降解作用。氯仿：有强烈的溶脂倾向，可以溶解细胞膜，同时溶解去除脂质类杂质，此外具有使蛋白质变性并分相的作用。异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡（泡沫）。 其余试剂见实验原理部分。
2、在质粒DNA的提取过程中，应注意哪些操作，为什么？
（1）各步骤中的混匀过程要温和，因为质粒DNA是环状生物大分子，若是过于剧烈，极易收集到破碎、断裂的片段而不是完整的超螺旋DNA；
（2）各步骤中的试剂的量要适当，过量和不足都会影响实验结果。 （3） 提取过程中应尽量保持较低温度。
（4） 加入溶液II和溶液III后操作应混和,切忌剧烈振荡。 3、琼脂糖凝胶电泳操作应注意哪些环节？
（1）倒胶时把握好胶的温度，不要高于60oC，否则温度太高会使制胶板变形。
（2）胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要垂直向上，不要弄坏点样孔。
（3）配胶和灌电泳槽需使用同一缓冲液。pH或离子强度很小的差别也会在凝胶前部造成紊乱，影响DNA片段的泳动。
（4）加样时需将枪头深入加样孔内再吹出样品，以免样品从凝胶表面扩散；加样时枪头不要刺穿或碰坏凝胶孔壁，否则将导致样品将从凝胶底部扩散或DNA带型不整齐。此外点样孔内不能有气泡。
（5）样品应加在阴极端，没加完一个样品要更换枪头，防止相互污染。 （6）观察时在透射仪的样品台上铺一张保鲜膜，赶去气泡。 （7）要选择合适的电压、pH等条件。 讨论心得：
1、质粒在正常情况下以超螺旋构型存在，在提取过程中由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能会使DNA链发生断裂。
2、DNA泳动速率受到多方面因素的影响。
3、溴化乙锭（EB）为致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染。
4、用无水乙醇沉淀DNA：乙醇可以任意比和水相溶，乙醇与核酸不会起化学反应，不会破坏DNA。DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺取DNA周围的水分子，使DNA失水而易
于聚合。本次实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混，其含量约为67%，因此可以考虑用95%乙醇，但是DNA回收率可能会下降。
5、 提取过程中应尽量保持较低温度。
6、加入溶液II和溶液III后操作应混和,切忌剧烈振荡。
7、要尽可能充分利用提取物，可增加产率；但是在不同情况和实验要求下应在产率和质量之间进行必要地调节。
8、对于实验步骤（二）中第5步的絮状沉淀不需要摇碎，摇碎沉淀一方面容易造成剧烈震荡，破坏DNA结构，另一方面破碎的沉淀可能会降低提取物的质量。
9、观察时要注意安全，防止紫外线直射眼睛。
10、实验过程应保持一定的连续性，不应当做做停停，以减少外界条件的影响。
附：琼脂糖核酸电泳实验操作流程
1.用蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗干净，放在制胶平板上，封闭模具边缘，架好梳子； 2.根据欲分离DNA片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶：准确称量琼脂糖干粉，加入到配胶用的三角烧瓶内，定量加入电泳缓冲液（一般20~30 ml）；
3.放入到微波炉内加热熔化。冷却片刻，加入一滴荧光染料，轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液，倒入电泳槽中，待其凝固；
4.室温下30~45分钟后凝胶完全凝结，小心拔出梳子，将凝胶安放在电泳槽内；
5.向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面1mm为宜，如样品孔内有气泡，应设法除去； 6.在DNA样品中加入10×体积的载样缓冲液（loading buffer），混匀后，用枪将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内；
7.接通电源，红色为正极，黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动 (靠近加样孔的一端为负)。一般60～100V电压，电泳20～40min即可； 8. 根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳；
9.电泳完毕，关上电源，在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准Marker比较被扩增产物的大小。
浙江大学生物化学丙实验报告6 - 图文
