实验一 显微镜的使用及微生物大小测定的方法
一、实验目的
1、学习并掌握油镜的原理和使用方法。 2、复习普通光学显微镜的结构、各部分的功能和使用方法。 3、学习并掌握用测微尺测定微生物大小的方法。 4、增强微生物细胞大小的感性认识。
二、基本原理
现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，它们由机械装置和光学系统两大部分组成。物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。其中油镜的放大倍数最大，对微生物学最为重要。
微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物大小的测定，需要在显微镜下，借助于特殊的测量工具—测微尺，包括目镜测微尺和镜台测微尺。其中镜台测微尺并不直接用来测量细胞大小 ，而是用于校正目镜测微尺每格的相对长度。目镜测微尺每小格所代表的实际长度因显微镜的不同放大倍数而异，因此用目镜测微尺测量微生物大小时，必须先用镜台测微尺进行校正，以求出该显微镜在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度，然后根据微生物细胞相当于目镜测微格数，即可计算出细胞的实际大小。
三、实验器材及药品 大肠杆菌、金黄葡萄球菌、放线菌、曲霉等微生物染色标本；
香柏油，二甲苯，目镜测微尺，镜台测微尺，显微镜，擦镜纸等。 四、操作步骤与方法
(一)显微镜的使用(参见P17) 1、观察前的准备(略) 2、显微观察 一般地，进行显微观察时应遵守从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序，因为低倍镜视野相对大，易发现目标及确定检查的位置。
1)低倍镜观察 2)高倍镜观察 3)油镜观察
(二)微生物大小的测定
1、装目镜测微尺(由教师操作并演示) 2、校正目镜测微尺
1)放镜台测微尺 将镜台测微尺刻度面朝上放在显微镜载物台上。
2)校正 先用低倍镜观察，将镜台测微尺有刻度的部分移至视野中央，调节焦距，当清晰地看到镜台测微的刻度后，转动目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度平行。利用移动器移动镜台测微尺，使两尺在某一区域内两线完全重合，然后数出两重合线之间镜台测微尺和目镜测微尺所占的格数。
用同样的方法换成高倍镜和油镜进行校正，分别测出在高倍镜和油镜下，两重合线之间两尺分别所占的格数。
3)计算 根据下列公式可计算出在不同放大倍数下，目镜测微尺每格所代表的长度
两重合线间镜台测微尺格数×10 目镜测微尺每格长度=
两重合线间目镜测微尺格数 3、菌体大小测定
取下镜台测微尺，换上细菌染色制片，先用低倍镜和高倍镜找到标本后，换油镜测定金黄葡萄球菌的直径和大肠杆菌的宽度和长度各占目镜测微尺的格数，最后再乘上该放大倍数下目镜测微尺每格所代表的长度，即为该菌的实际大小。
4、测量完毕 取出目镜测微尺后，将接目镜放回镜筒，再将目镜测微尺和镜台测微尺分别用擦镜纸擦拭干净，放回盒内保存。
五、原始数据记录与数据处理
1、原始数据记录：包括微生物形态观察和微生物个体的大小测定两部分。
每位同学观察3种微生物染色标本，其中大肠杆菌和金黄葡萄球菌染色标本必看，其它一种在青霉、曲霉、放线菌和酵母菌中任意选择。
每位同学均测定大肠杆菌和金黄葡萄球菌2种染色标本中的微生物个体大小。 记录你所选择的哪3种微生物染色标本进行形态观察的和大小测定的。 2、数据处理：
1) 形态观察：要按从搜物镜→低倍镜→高倍镜→油镜的顺序画图描述(注意比例)观察到的微生物群体或个体形态。
2) 大小测定：
A、将目镜测微尺校正结果埴入下表 接物镜 接物镜倍数 目镜测微尺格数 镜台测微尺格数 目镜测微尺每格代表的长度/um 低倍镜 高倍镜 油镜
10× 40× 100× 接目镜放大倍数：
B、将各菌测定结果填入下表(单位：/μm) 微生物目镜测微尺每格名称 代表的长度/um 宽 目镜测微尺格数 大肠杆菌 宽度/um 目镜测微尺格数 长 长度/um 菌体大小范围/um 金黄色葡萄球菌 六、思考题
1、用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间加滴什么油？起什么作用？
2、影响显微镜分辨率的因素有哪些？
3、为什么要换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正？
4、在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一微生物的大小时，其测定的结果是否相同？为什么？
实验二 显微镜直接计数法
一、目的要求
1、明确血细胞计数的原理。
2、掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。 二、基本原理
显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上（又称计菌器），其优点是直观、快速、操作简单。目前国内外常用的计菌器有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌器及Hawksley计菌器等。利用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。此法是将单细胞微生物的悬液或孢子悬液，注入血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中。在显微镜下进行计数的，由于加盖盖玻片之后的血球计数板的计数室的容积是一定的（0.1mm3，万分之一毫升），所以可根据在显微镜下观察到的微生物数目来计算单位体积内的微生物总数目，包括死菌和活菌。
三、实验器材
1、菌种：酿酒酵母菌悬液
2、仪器或其他用具：血细胞计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细滴管。 四、操作步骤 1、菌悬液制备
以无菌生理盐水将酿酒酵母制成浓度适当的菌悬液。 2、镜检计数室
在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗，吹干后才能进行计数。
3、加样品
将清洁干燥的血细胞计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀的酿酒酵母悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用进入计数室，一般计数室均能充满菌液。
取样时要小心摇匀菌液；加样时计数室不可有气泡产生。
4、显微镜计数
加样后静止5min，然后将血细胞计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。
调节显微镜光线的强弱适当。一般地，在使用低倍物镜时，应尽量调弱光线，使视野变暗；使用高倍物镜时，再将光线调亮些，但也应尽量保证能看清视野中计数板上的纵、横格线。
在计数前若发现菌液太浓或太稀，则需重新调节稀释度后再计数，一般样品稀释度要求每小格内约有5～10个菌体为宜。每个计数室选5个中格（可选4个角和中央的一个中格）中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如
遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作为两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算样品的含菌量。
5、清洗血细胞计数板
使用完毕后，将血细胞计数板在水龙头上用水冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后自行凉干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体后其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。
五、原始数据记录与数据处理 1、原始数据记录：
每个班用同一浓度的酵母菌浓悬液，使用时由同学根据需要自行稀释，并确定稀释倍数B值。
每个同学计二个室（即1个计数板），每个室选4个角和中央的一个中格这5个中格中的菌体进行计数，读出每个中格的16个小格中的菌体数（5～10），并将原始数据记录下来。 2、数据处理：
将结果记录于下表中。A表示五个中方格中的总菌数；B表示菌液稀释倍数。 1 第一室 第二室 各中格中菌数 2 3 4 5 A B 二室 平均值 菌数/ml 每组同学可将各自测定的实验结果并写在一个表格中，最后结果则为四个室的平均值。只需计算一次，不要分别计算二个室的平均值后再求平均值。 六、思考题
根据你的体会，说明用血细胞计数板计数的误差主要来自哪些方面？应如何尽量减少误差，力求准确？
实验三 微生物学实验室常用器皿的清洗、包装与干热灭菌
一、实验目的
1、了解微生物学实验室常用的器皿和工具的种类、要求和应用。 2、掌握微生物实验室常用的玻璃器皿的清洗及包装方法。 3、了解干热灭菌的原理和应用范围。 4、掌握干热灭菌的操作技术。 二、基本原理
微生物学实验所用的器皿，大多要进行消毒、灭菌和用来培养微生物，因此对其质量、洗涤和包装方法均有一定的要求。玻璃器皿的形状和包装方法要求能防止污染杂菌为准；玻璃器皿的洗涤方法根据实验目的、器皿的种类、所盛的物品、洗涤剂的类别和沾污程度等的不同而有所不同。清洗后的玻璃器皿、经包装后即可进行干热灭菌。 干热灭菌有火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种（P59）。火焰烧灼灭菌适用于载玻片、试管口、玻棒、接种工具和金属用具如镊子等的灭菌。通常所说的干热灭菌是在电烘箱内利用高温干燥空气使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。而细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固变越快，反之反之。与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高（160－170℃），时间长（1-2h）.但干热灭菌温度不能超过180℃，否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。此法适用于玻璃器皿如吸管和培养皿等的灭菌。培养基、橡胶制品、塑料制品、衣物等不能用干热灭菌。 三、实验器材 微生物实验室常用的器皿、接种工具、电热鼓风干燥箱等 四、操作步骤 1、微生物实验室常用的器皿简介（P2－6） 试管、吸管、培养皿、三角烧瓶、载玻片、盖玻片、双层瓶、滴瓶、接种工具等。
2、微生物实验室常用的器皿清洗方法（P6） 1）新玻璃器皿的洗涤方法（P6）；
2）使用过的玻璃器皿的洗涤方法（P6）。 3、空玻璃器皿的包装（P7－8） 1）培养皿的包装； 2）吸管的包装；
3）试管和三角烧瓶的包装
注意：做棉塞的方法（P53－54）
4、包装过的玻璃器皿的干热灭菌方法（P62-63）
装入待灭菌物品；升温；恒温；降温；开箱取物；无菌检查。 五、原始数据记录与数据处理 1、原始数据记录
领用了哪些玻璃器皿、清洗了哪些玻璃器皿、包装了哪些玻璃器皿。 2、数据处理
清洗效果、老师评价；包装效果、老师评价；干热灭菌条件及结果。 六、思考题（P63）
1、为什么在吸管的包装时要在其粗端吸管口塞上一小段棉花？ 2、在干热灭菌操作过程中应注意哪些问题，为什么？ 3、为什么干热灭菌比湿热灭菌所需要的温度高，时间长？
微生物学实验备课笔记发
