HBx基因诱导肝卵圆细胞恶性转化并促进其发生侵袭转移*
刘顺芳1, 董可帅 2, 张尊义 2, 董汉华2△
【摘 要】摘要：目的 研究HBx对肝卵圆细胞发生恶性转化并上皮-间质转化(EMT)的影响。方法 以稳定表达HBx的转基因卵圆细胞株pEGFP-HBx-LE/6为实验组，pEGFP-LE/6卵圆细胞为对照组。使用Western blotting、Transwell细胞侵袭实验、划痕实验、CCK-8等检测pEGFP-HBx-LE/6在细胞周期、分化标志物以及增殖转移能力方面的变化。结果 ①实验组细胞体积增大、具有明显异形性，CK-19、CK-7表达明显下降，AFP、HNF-4α表达升高；②实验组细胞的增殖能力明显升高，克隆形成能力、侵袭能力、划痕恢复能力明显增强；③与对照组比较，实验组E-cadherin表达水平明显下降，而N-cadherin、α-SMA、Vimentin表达水平明显上升。结论 HBx基因可诱导肝卵圆细胞向恶性转化，并促进其转移。 【期刊名称】华中科技大学学报（医学版） 【年(卷),期】2017(046)004 【总页数】4
【关键词】卵圆细胞； HBx； 上皮-间质转化
肝卵圆细胞被认为是肝脏前体干细胞，体内外实验证实其可以根据局部微环境的不同分化为多种细胞，并且参与了肝癌的发生发展过程[1]。目前肝细胞癌的治疗难点主要在于肝切除术后容易复发、容易伴发肝内播散及血管侵犯。我们的前期研究发现动物以及人肝切除术后标本均可发现卵圆细胞增殖明显增强，肝内种植转染了乙型肝炎病毒X基因(HBx)的卵圆细胞可以导致原位发生肝细胞癌[2]，肝内微环境的改变可以显著改变肝卵圆细胞的分化状态，导致肝癌的
发生。但是目前对于肝脏前体干细胞与肝细胞癌伴发肝内播散以及血管侵犯的关系并不清楚。为此我们将携带HBx的质粒转入大鼠卵圆细胞(LE/6)并进一步观察其侵袭转移能力的变化，为肝卵圆细胞作为肝癌起源提供进一步的证据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
波形蛋白(Vimentin)、细胞角蛋白(CK-7、CK-19)、HBx、甲胎蛋白(AFP)、肝细胞核因子4α(HNF-4α)、上皮钙黏素(E-cadherin)、神经钙黏素(N-cadherin)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)等的抗体均购自Santa Cruz公司(美国)，胎牛血清购自Gibco公司(美国)，OPTI-MEM和Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司(美国)。 1.2 细胞培养
大鼠肝卵圆细胞LE/6细胞株由美国华盛顿大学病理科Nelson Fausto教授馈赠，使用含有10%胎牛血清、1 μg/mL胰岛素(Sigma公司)、0.5 μg/mL氢化可的松(Sigma公司)的Ham’s F-10培养液(Gibco公司)在37℃、5%CO2条件下常规培养传代。 1.3 细胞转染
选择对数生长期的LE/6细胞，当6孔培养板细胞汇合度达到80%时，经10 μL的Lipofectamine2000(用OPTI-MEM稀释)介导pEGFP-HBx或者pEGFP转染LE/6。6 h后将培养液更换为含10%胎牛血清的F-10培养液。 1.4 Western blot检测
使用RIPA蛋白裂解液在冰上裂解肝癌、癌周组织以及培养细胞，按常规方法提取总蛋白。BCA法测定蛋白浓度，将40 μg蛋白加至10%SDS-PAGE(十二
烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶)电泳，按常规方法将蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Millipore公司)上，用含5%脱脂奶粉的Tris-HCl缓冲液(TBST)37℃封闭1 h，然后加入相应一抗，4℃摇床中过夜，TBST洗涤10 min×3次，加入相应的稀释二抗在37℃孵育1 h，ECL化学发光试剂孵育PVDF膜后，放入图像采集仪器中，采集图像。 1.5 细胞增殖能力检测
CCK-8检测：取对数生长期的pEGFP-LE/6以及pEGFP-HBx-LE/6细胞，于10%胰酶消化1 min后，分别计数，按每孔1 000细胞平铺于96孔板，每组各设3个复孔，于细胞培养箱培养12 h，分别于贴壁后24、48、72、96 h按培养液∶CCK-8原液=10∶1加入培养液中，常温孵育1 h后，检测其460 nm处吸光度值。克隆形成实验：取对数生长期的pEGFP-LE/6以及pEGFP-HBx-LE/6细胞，于10%胰酶消化1 min后，分别计数，按每孔100细胞平铺于6孔板，每组各设3个复孔，于细胞培养箱培养2周，吸弃培养液。加入甲醛溶液固定10 min，吸弃上清后加入结晶紫染液染色5～10 min，图像检测。 1.6 细胞侵袭能力检测
划痕实验取对数生长期的pEGFP-LE/6以及pEGFP-HBx-LE/6细胞，于10%胰酶消化1 min后，分别计数，按每孔1×10 5细胞将其平铺于6孔板，于恒温细胞培养箱培养观察，待其汇合度达到100%后，将培养液换为不含血清的F-10培养液，取10 μL移液器枪头在培养皿轻轻划出一痕迹，于0、4、8、12 h于倒置显微镜下拍照观察划痕恢复情况，计算测量时划痕宽度与初始划痕宽度的比值。Transwell细胞侵袭实验：将Matrigel胶质置于冰上静置1 h，待其液化，迅速吸取10 μL与40 μL无血清DMEM培养液混合均匀，加入到
HBx基因诱导肝卵圆细胞恶性转化并促进其发生侵袭转移
