H9亚型禽流感病毒血凝素蛋白在原核系统中的表达

H9亚型禽流感病毒血凝素蛋白在原核系统中的表达

石 锐1，包红梅2，姜永萍2，乔传玲2，陈化兰2，王秀荣2*，陈维多3 【摘 要】应用带有His6尾的pET原核表达系统对禽流感病毒血凝素蛋白进行表达，将禽流感A/Turkey/Wisconsin/66(H9N2)的HA基因克隆至原核表达载体pET－30a中，经酶切、PCR扩增和测序分析确证其插入，并且阅读框正确，获得重组质粒pET30a－H9。将此重组质粒转化到宿主菌BL21中，用诱导剂异丙基硫代－β－D半乳糖苷（IPTG）进行诱导，产物处理后进行SDS－PAGE电泳、免疫印迹和薄层扫描分析。结果发现HA蛋白可被大量表达，主要以包涵体形式存在，表达产物分子质量约64 ku，与理论推测值一致；菌液OD600值为1.0、IPTG终浓度为0.3 mmol·L－1、诱导时间4 h，其蛋白表达量最大，约占菌体蛋白总量的35%左右；通过免疫印迹试验发现，表达的蛋白可被禽流感H9亚型阳性血清特异性识别。研究结果表明，可以用原核表达系统对禽流感病毒血凝素蛋白进行表达，其产物具有免疫原性，可以用作禽流感抗体检测的免疫诊断试剂。 【期刊名称】东北农业大学学报 【年(卷),期】2011(042)012 【总页数】5

【关键词】禽流感；H9；原核表达

禽流感（Avian influenza，AI）A型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）所引起的禽类疾病[1]，严重威胁全世界养禽业的重要疾病。AIV为单股负链RNA，由8个独立的RNA节段组成，其中片段4编码血凝素（HA）糖蛋白，位于病毒的表面，呈棒状，是构成流感病毒囊膜纤突的主要成分之一，

其抗体能中和流感病毒的感染，是主要的保护性抗体[2]。

HA是典型的I型蛋白，含有4个结构区域：信号肽（前导序列）、胞浆域、跨膜域和胞外域[2]。HA在病毒吸附及穿膜的过程中起关键作用，可刺激机体产生中和抗体[3]。在感染过程中可被水解为两条肽链HA1和HA2，是感染细胞的先决条件[4]。另外，HA的变异性很强，是病毒发生抗原变异的主要原因[5]。HA还参与病毒宿主谱的识别，在病毒宿主范围的界定上扮演重要角色[5]。 本试验选取了H9亚型禽流感病毒，以pET-30a作为表达载体，在原核系统表达禽流感病毒血凝素蛋白，旨在获得有活性的血凝素蛋白。为进一步阐明禽流感病毒血凝素蛋白的结构与功能，分析其生物学活性并为研制免疫诊断试剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 质粒、载体与菌株

禽流感H9N2亚型病毒质粒由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室（以下简称本室）保存，并已测序。克隆载体为pMD18-T Vector，购自宝生物工程（大连）有限公司（TaKaRa Biolatalog），表达载体为pET-30α，大肠杆菌菌株JM109、BL21由本室保存。 1.2 酶和试剂

DNA Polymerase、限制性核酸内切酶、T4DNA Ligase（购自 TaKaRa 公司）；蛋白 Marker、X-gal、IPTG、胶回收（小量）试剂盒、质粒（小量）抽提试剂盒（购自上海华舜生物工程公司）。辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgG（购自KPL公司）；DAB显色试剂盒（购自博士德生物工程有限公司）。 1.3 引物

根据参考序列D90305，用Oligo4.0软件设计PCR引物，根据载体特性上游引物中引入HindⅢ酶切位点，下游引物中引入XhoⅠ酶切位点。目的片段1 552 bp，不包括信号肽和疏水区。

H9上游引物5′TAA AAG CTT CAG CAG CCA ATG CT 3′ H9下游引物5′TAA ATC TCG AGG ATC TAG TAA GTG C 3′ 1.4 表达载体的构建

1.4.1 目的基因的分子克隆和鉴定

以H9N2亚型质粒AIV HA基因为模板，用含有酶切位点的 H9 引物（20 μmol·L-1）进行扩增。PCR反应条件为95℃5 min，94℃1 min，52℃1 min，72℃ 2.5 min，循环35次后72℃延伸10 min。1%琼脂糖凝胶电泳鉴别为阳性后，用（小量）胶回收试剂盒回收。 1.4.2 酶切、连接目的基因和载体

上述胶回收产物已在目的基因上下游引入了HindⅢ和XhoⅠ酶切位点，用这两种酶双酶切目的基因的PCR回收产物及pET-30α质粒，37℃酶切2 h。（小量）胶试剂盒回收。用T4DNA连接酶将带有粘性末端的目的基因和载体连接，室温1 h以上。

1.4.3 重组质粒pET30α-H9的鉴定

将连接产物转化感受态细胞JM109中，涂平板（含卡那霉素），不加X-Gal、IPTG。挑取白色菌落，摇菌增殖。提质粒后，进行PCR和双酶切鉴定。测序鉴定是否为正向连接。

1.4.4 重组质粒转化BL21表达菌

将鉴定为正向连接的阳性重组质粒转化BL21感受态细胞，构建重组菌。