紫外分光光度计在蔬菜农药残留检测中的应用

农 药 残 留

农药使用后残存在生物体、农副产品和环境中的农药原体、有毒代谢物、降解物和杂质的总体叫做农药残留。

人们往往只把农药原体的残留量认为是农药残留量，忽略了有毒代谢物及其降解物。实际上不仅原药有毒，其代谢产物和杂质的慢性毒性与原药相当或更严重，如滴滴涕的代谢产物滴滴依，工业六六六的代谢产物乙体六六六，农药1605的代谢产物1601，其毒性比原体更强。杀虫脒代谢产物的毒性是原药的10倍。残留量是以原药及有毒的代谢产物的总残留计，残留时间很长。 农药残留的来源

直接喷洒的农药除部分着落在农作物上，大部分落入土壤中，土壤中的农药残留，一般不会直接引起人们中毒，但它是农药的储存库和污染源。土壤中的农药可被作物吸收，可蒸发逸失进入大气，亦可经雨水或灌溉流入河流或地下水中。如残留期长的六六六可被胡萝卜、花生等吸收。最危害的是，它可以通过食物链富集，如称为“世纪之毒”的二恶英，在鱼体内的富集系数可达到104。在食物链中，处于最高位臵的人体中往往富集较大剂量的高残留农药。 农药残留的危害

农药的大多数品种用来防治农业的有害生物，它们一般对人体也是有害的。农药对人的毒性可分为急性和慢性。急性中毒是指依次或短时间内大量摄入农药而发生的急性病理性反应。这种中毒农药一般是通过消化道、呼吸或者皮肤三种途径进入人体内。慢性中毒指长期连续少量摄入农药最终发生病理反应，这种中毒农药主要是通过食物进入人体。慢性中毒中，致癌、致畸和致突变在国际上称为“三致”，应特别值得注意。有的农药有效成分或有毒代谢物北人体长期微量摄入后，因代谢和排泄量少，在人体的某些器官、组织中积存，这叫做农药的积蓄性毒性，属慢性中毒的范畴。某些农药在施用后，其有毒的有效成分及其有毒的降解产物、衍生物和代谢产物在农作物和环境中长期滞留，污染了农、畜产品和环境，形成了农产品残留问题和环境污染问题，对人构成了慢性毒性的威胁。 六六六和滴滴涕对人体的影响主要是对肝脏组织和肝功能的损害。实验动物和人体资料都表明六六六和滴滴涕能引起血液细胞染色体畸变。值得重视的是，有机氯能透过胎盘进入胎儿体内，同时还可通过母乳排出。

有机磷农药是神经毒物，进入人体后主要是抑制血液和组织中的乙酰胆碱酯酶的活性，引起神经功能紊乱、出汗、震撼、精神错乱、语言失常等一系列表现。 氨基甲酸脂类农药其中毒症状与有机磷农药是一致的，但较有机磷中毒恢复为快。

拟除虫菊脂类农药的毒性一般较大，对鱼类毒性很高，有一定的积蓄性，中毒表现症状为神经系统症状和皮肤刺激症状。

大量使用的杀菌剂、除草剂等也会造成农药的污染和在蔬菜中的残留。 蔬菜上农药残毒检验的必要性

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蔬菜遭受病虫侵害会使蔬菜的品质、商品性下降，因此以化学防治为主的蔬菜病虫害防治在蔬菜生产过程中显得很重要。长期大量的使用农药，使蔬菜上含有对人体有害的残毒物，这是无法避免的事实，严重的超量农药残毒，可以造成人体的急性中毒，而较轻微的残留量，也可导致多种慢性疾病。 造成蔬菜农药污染的原因 蔬菜生产者的质量意识差

长期以来，我国对蔬菜产品的质量未受到应有的重视。随着农业结构的调整，调动了农民发展商品生产的积极性。蔬菜的效益高，投资见效快，因此生产规模迅速扩大。我国常年生产面积较大的蔬菜品种有50～60种，病虫种类约1300种，重要的病虫有60多种。由于各种蔬菜发生病虫害的种类不同，因此病虫害的防治本身也是一件不容易的事情、部分农民不合理的使用农药，同时为了追求经济效益，在安全期内也使用农药。特别是瓜果及豆类蔬菜采收期长，即使是在采收期内，也要喷洒农药，造成蔬菜农药残留超标的现象时有发生。 农药的种类多

我国是一个农药生产和使用大国，据统计，目前我国生产农药有效成份1800多个，产品400多种。但是由于许多农民缺乏科学合理使用农药的知识，误用农药和滥用农药，特别是使用国家明令禁止在蔬菜水果上使用的农药，如甲胺磷，克百威等。如1999年浙江省对本省四个市的蔬菜生产基地39批次样品的检查中，有19批检出有甲胺磷，检出率达到46％。 菜田环境发生了显著的变化

由于农药的长期使用，造成菜田环境的显著变化。许多益虫消失，菜田生态系统失去平衡，导致病虫害的进一步发展，从而加大农药使用的数量和次数。 长期使用农药，病虫抗药性增强

由于长期使用农药，导致病虫害的抗药性普遍产生。如拟除虫菊酯的多年连续使用，使许多害虫产生了抗药性，以至于用量增加才能达到防治的效果。如瓜蚜对菊酯类杀虫剂的抗性已较原始毒力显著提高，如氰戊菊酯提高500倍，溴氰菊酯提高约400倍。用氰戊菊酯防治小菜蛾，在三年的时间里，农药的使用浓度提高了5～20倍，在一个菜季里的用药次数从3～5次提高到25到30次才能有效的控制害虫的危害。 农药的质量差

农药制品的纯度不合格，其中杂质也是造成蔬菜污染的原因之一。如乙酰甲胺磷本是一种低毒农药，但由于质量差，其中含有高毒甲胺磷。又如三氯杀螨醇原为低毒的农药，但是因为质量问题，在制品中含有一定量的滴滴涕。我国的出口茶叶就面临这一问题。 农药残留物对环境的污染

过去大量的使用有机氯杀虫剂，如六六六，滴滴涕等残效长的农药，在某些类型的土壤中还保留一定程度的残留量。这些积累与土壤中的农药及其降解产物也是导致蔬菜残留的原因之一。

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由于蔬菜中残留的农药直接威胁到人体的健康，因此，农药残留的测定对于阻止农残超标蔬菜进入市场至关重要。 农药残留的检测方法

常规理化方法一般通过使用气相色谱仪（GC）、液相色谱仪（LC）、质谱仪（MS）等仪器设备，根据不同农药的理化性质和化学结构不同而进行定性定量分析。该方法结果精确，为农药残留量的鉴定方法，但使用的仪器设备昂贵，样品处理过程繁琐，花费时间也长。

生物测定方法包括：活体测定法、酶联免疫法和酶抑制法。 （一）活体测定法

由于农药与细菌作用后可影响细菌的发光程度，或喂食敏感家蝇，农药残留导致家蝇中毒，通过测定细菌发光情况或家蝇死亡率则可以测出农药残留量，由于该方法使用活的生物故称为活体测定法。

活体生测系用活体生物为供试材料，现一般利用实验室饲养的敏感性家蝇作为试验材料，以这种家蝇接触供检测蔬菜后的中毒程度，来表示供检蔬菜是否遭受农药及其被污染的程度。如安达市植检站利用敏感家蝇对蔬菜低残毒生产区的蔬菜进行大面积多点次的检测工作，查出严重超标的蔬菜占0.15％。此种方法简单易行，不需要大型仪器设备，成本低，可在较短的时间内（3h）对蔬菜中的农药残留情况有所了解，但不能定性定量。用于超毒蔬菜的筛选时比较方便快捷，适用于基层。 （二）酶联免疫法

利用ELISA方法进行农残检测时，首先需将小分子的农药与大分子的载体蛋白结合，然后免疫兔子等动物产生抗体。用这种方法产生的抗体为抗农药多克隆抗体。多克隆抗体具有生产成本低，生产方法简便，但是其特性会随动物的种类，甚至同一动物的不同血液而发生变化，而且同一批动物产生的血清也是有限的。 一种产生可无限的提供抗体的方法是生产杂交瘤细胞系。这种方法是利用正常的生活周期短的产生抗体细胞与生活周期长的癌细胞融合产生新的杂交细胞，这种细胞具有两个亲本的特征，由这种细胞产生的单克隆抗体具有一种类型抗体的同源性，可以大批量地、长期地生产。

免疫方法具有专一性强、灵敏度高、快速、操作简便等特点，但是每次只能检测一种农药或与其结构密切相关地农药或该农药地代谢产物。若需进行多残留检测，可以将几种农药的抗体混合。目前我们所用的农药种类繁多，使用这种方法进行多残留检测，实际上还有一定的困难。 （三）酶抑制法

有机磷酸酯类、氨基甲酸酯类和拟除虫菊酯类是目前杀虫剂的三大支柱，特别是有机磷酸酯类杀虫剂仍在生产上起主导作用，更是菜农喜欢使用的一类杀虫剂。

酶活性抑制测定是利用有机磷和氨基甲酸酯类农药具有抑制乙酰胆碱酯酶活性。乙酰胆碱酯酶是一种水解酶，使乙酰胆碱分解为乙酸和胆碱，乙酰胆碱酯酶

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抑制剂与正常底物争夺乙酰胆碱酯酶结合部位，形成稳定的抑制剂——乙酰胆碱酯酶复合体，使酶丧失活性。

乙酰胆碱酯酶+有机磷或氨基甲酸酯类农药→酶活性被抑制。

乙酰胆碱酯酶+样本，如活性被抑制则含有机磷或氨基甲酸酯类农药，如活性不被抑制则不含此类物质。

目前，此方法主要是将乙酰胆碱酯酶与蔬菜样本提取液混合，以碘化乙酰胆碱酯酶（AtchI）为底物，二硫双硝基苯甲酸（DTNB）为显色剂，经一段时间后比色，根据吸光值，计算乙酰胆碱受抑制的程度。 （1）残毒速测箱

速测箱具有以下特点：快速（每样需要15-20min）、简便、容易使用、不需要贵重设备和专门技术人员，成本低（每样需要用0.50元）适用于田间筛选大量样品且所用的酶片和显色基质片在常温下、干燥条件下能保存2年以上。 （2）比色法

利用此方法对蔬菜、果品及农产品进行农药残留测定，灵敏度高，操作简便，检验速度快，可检测多种农药的综合残留量。 （3）乙酰胆碱酯酶传感器

近年来，测定农药的生物传感器研究取得了长足进步，测定方法多样化、测灵敏度越来越高、仪器自动化程度提高、响应时间缩短、适应现场检测能力越来越强。然而方法的选择性有限，原理仅限于胆碱酯酶的功能被抑制。生物材料胆碱酯酶的失活包括生物材料固定化过程中的失活始终困扰着这一研究领域，随着新技术、新材料的不断涌现，生物传感器必将更加小型化、实用化、商品化。 由于酶联免疫法和酶抑制法都能几个小时内得出结果，速度很快，成本较低，所以被应用于农药残留的快速检测。其中，酶抑制法应用最为普遍，

目前农药的快速测定包括：使用农药残毒快速测定仪测定和使用农药残毒快速测定试纸测定两种方式。

农药残毒快速检测方法的开展情况

目前蔬菜上农药残毒快速检测的技术在香港、台湾地区以及东南亚一些国家如泰国、越南等已广泛应用，我国的一些省市的蔬菜批发市场也已经或准备建立农药残留快速检测实验室，用快速检测方法，对进入批发市场的蔬菜定期抽样检测，进行粗筛，将一部分含农药残留量高的蔬菜控制在交易市场之外，让人们吃上相对安全的蔬菜，避免农药中毒事故的发生，减少农药残留对人们的危害。

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GB/T5009.199-2002

蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留快速检测方法

酶抑制率法

1范围

本标准规定了由酶抑制率法测定蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的快速测定方法。

本标准适用于蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的快速测定。 2原理

在一定条件下，有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶正常功能有抑制作用，其抑制率与农药的浓度呈正相关系。正常情况下，酶催化神经传导代谢产物(乙酰胆碱)水解，其水解产物显色剂反应，产生黄色物质，用分光光度计测定吸光度随时间的变化值，计算出抑制率，通过抑制率可以判断出样品中是否含有有机磷或氨基甲酸酯类农药的存在。 3试剂

3.1pH8.0缓冲溶液：分别取11.9克无水磷酸氢二钾与3.2克磷酸二氢钾，用1000毫升纯水水溶解。

3.2显色剂：分别取160mg二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）和15.6mg碳酸氢纳，用20ml缓冲溶液溶解，4?C冰箱中保存。

3.3底物：取25.0mg硫代乙酰胆碱，加3.0ml蒸馏水溶解，摇匀后置4℃冰箱中保存备用，保存期不超过两周。

3.4乙酰胆碱酯酶：根据酶的活性情况，用缓冲溶液溶解，按5.3测定项操作，?A0值应控制在0.3以上。 3.5纯水 4仪器

4.1普析通用紫外可见分光光度计TU1800或1800PC 4.2常量天平

4.3恒温水浴锅或恒温箱

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4.4移液枪，20－100mL 4.5带塞子的椎型瓶100mL 4.6带塞子的试管5mL 4.7量筒50mL 5分析步骤 5.1样品处理

选取有代表性的蔬菜样品，擦去表面泥土，剪成1cm左右见方碎片，取样品1g，放入烧杯或提取瓶中，加入5ml缓冲溶液，振荡1