烟草C3HC4型锌指蛋白的原核表达及转基因植株功能研究

烟草C3HC4型锌指蛋白的原核表达及转基因植株功能研究

伍文宪1，2 杨秀芬1 刘勇2 邱德文1

【摘 要】 植物中C3HC4型RING锌指蛋白在泛素化、光形态建成、抗逆及生长发育等过程中均起到非常重要的作用。首次从本生烟中扩增获得一个锌指蛋白基因的完整阅读框，编码203个氨基酸，含有C3HC4型锌指结构域，命名为NbZFP1。将NbZFP1基因分别克隆到原核表达系统载体pGEX-6P-2以及pMAL-C2X中，成功构建了重组表达载体pGEX-6P-2-NbZFP1与pMALC2X-NbZFP1，经IPTG获得了大量可溶性表达的NbZFP1融合蛋白。将NbZFP1基因克隆于植物表达载体pBI121中，通过农杆菌介导法获得转基因烟草，PCR检测及Southern blot分析表明NbZFP1基因已整合到烟草基因组中，转NbZFP1基因烟草表现出株型紧凑，节间缩短，茎干粗壮和对TMV抗性增强。

【期刊名称】生物技术通报 【年(卷),期】2014(000)007 【总页数】6

【关键词】 锌指蛋白 重组表达 转基因烟草 抗病性

锌指蛋白是真核生物基因组中最丰富的一类转录因子，最初于1983年被发现存在于非洲爪蟾卵母细胞的转录因子TFIIIA中 ［1] ，锌指结构由多个半胱氨酸或（和）组氨酸组成，通过锌离子来维持结构的稳定性。锌指蛋白通过与目的基因的DNA或RNA结合，或与其他蛋白之间的相互作用来调控基因表达。根据半胱氨酸（C）和组氨酸（H）残基数及在蛋白中的位置，可将含锌指结构域的转录因子分为C2H2、C2C2、C3H、C3HC4（Zinc finger）和C3HC5

（LIM finger）5个亚类［2] ，C3HC4锌指蛋白具有较为简单的蛋白质结构［3] ，由能结合两个离子的4对双配体构成，不仅能结合DNA，还能与RNA，蛋白质和脂质结合［4] 。C3HC4锌指蛋白参与基因转录与重组，细胞间信号转导等各种生命过程，也能在蛋白间互作以及泛素化进程中发挥重要作用，许多C3HC4锌指蛋白本身就是E3泛素化连接酶，介导泛素化目标蛋白的转移［5] 。

植物C3HC4型锌指蛋白基因的研究多集中在拟南芥与水稻 ［6] 。为人们所熟知的拟南芥C3HC4型锌指蛋白有AtCOP1（参与光反应）、AtCIP8（参与光形态建成）［7] 、AtTED3（参与光信号传导）［8] 、AtRMA1（参与分泌途径）［9] 、AtXB3（参与根的发育）［10] 、AtSDIR1（抗逆反应）［11] 等。在水稻中，研究比较深入的C3HC4型锌指蛋白大多与光形态建成有关，主要包括OsCOP1、OsCOIN1、OsXB3.1和OsRHC1［7] 。目前，尚无对烟草中C3HC4型锌指蛋白的研究报道，本研究以诱导植物抗性的蛋白激发子Hrip1为诱饵蛋白，从烟草cDNA文库中首次获得本生烟C3HC4型锌指蛋白基因NbZFP1，建立该蛋白大肠杆菌体外重组表达系统，获得转基因烟草植株并分析转化株的表型特征和抗病功能，以期为进一步研究烟草C3HC4型RING锌指蛋白在生长发育以及蛋白激发子诱导植物抗性分子机制中的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 本生烟种子由本实验室保藏。

1.1.2 载体和菌株 原核表达载体pGEX-6P-2与pMAL-C2X、植物表达载体pBI121、农杆菌菌株GV3101均由本实验室保存，TMV-GFP病毒由清华大学

生命科学学院刘玉乐教授提供，大肠杆菌感受态BL21购自北京全式金公司。 1.1.3 仪器与试剂 蛋白纯化仪AKTA explorer 900（Amersham公司）；地高辛分子检测试剂盒（Roche公司）；植物组织RNA提取试剂盒（北京全式金公司）；mRNA反转录试剂盒（北京全式金公司）；各化学试剂均购自AMRESCO公司。 1.2 方法

1.2.1 总RNA提取及cDNA第一链的合成 采用植物组织RNA提取试剂提取本生烟总RNA，取2 μg mRNA用于cDNA第一链的合成（具体方法参见北京全式金公司反转录试剂盒说明书）。

1.2.2 NbZFP1的克隆与序列测定 以从烟草cDNA文库中获得的一段约200 bp的序列为信息探针，搜索本生烟SGN mRNA序列库，同源比较，设计一对特异性PCR引物：F-NbZFP1：5'-CG GGATCCATGTCACTTTCTGGTCGT-3'，R-NbZFP1：5'-GCGTCGACTCAGGTTTTCAGCCCTGT-3'（引物由北京华大公司合成）。PCR程序扩增目的基因：94℃预变性2 min；94℃变性30 s，55℃复性30 s，72℃延伸1 min，30个循环；最后72℃延伸10 min。目的条带经胶回收纯化后连接到pEASY-Blunt-Zero载体中，转化至大肠杆菌感受态细胞Trans5α，测序由北京华大公司完成。

1.2.3 NbZFP1原核表达重组质粒的构建 质粒提取、双酶切、连接及转化等参照试剂说明书和相关的分子生物方法［12] ，简要操作步骤如下：提取原核表达载体pGEX-6P-2、pMAL-C2X以及测序正确的pEASY-Blunt-Zero-NbZFP1转化子质粒，用限制性内切酶BamH I和Sal I双酶切并回收载体片段及目的基因片段NbZFP1，22℃连接15 min后转化至表达宿主菌E. coli