北京地区宠物犬布鲁氏菌的分离与鉴定
王 宁，韩吉寿，吕艳丽，吴清民*
【摘 要】自2012年11月至2013年6月，本实验室对北京市某动物医院送检的疑似患布鲁氏菌病宠物犬的38份血清进行抗体检测，22份阴道分泌物和2份抗凝血进行细菌分离。结果显示，18只宠物犬抗体检测为阳性，并且从5只抗体阳性的宠物犬体内还各分离到一株布鲁氏菌，其中4株为犬种布鲁氏菌，另一株生物型尚待确定。通过调查及临床症状的观察，推测病犬排泄物、流产物或者与病犬交配等可能导致布鲁氏菌病的传播，这为北京市宠物犬布病的流行性调查提供了一定的数据支持。 【期刊名称】中国预防兽医学报 【年(卷),期】2014(036)006 【总页数】3
【关键词】宠物犬；犬种布鲁氏菌；分离鉴定
布鲁氏菌病(以下简称“布病”)是由布鲁氏菌引起的人兽共患病，该病流行广泛，不仅影响畜牧业的发展，还直接威胁人类健康和公共卫生安全。
2006年之前将布鲁氏菌属分为6个种19个生物型，即羊种(B.melitensis)1-3型，牛种(B.abortus)1-7和9型，猪种(B.suis)1-5型，绵羊附睾种(B.ovis)、犬种(B.canis)、沙林鼠种(B.neotomae)各1个生物型。目前增加了4个新种：B.pinipedialis(分自鳍足类)、B.ceti(分自鲸鱼和海豚)、B.microti(分自田鼠)、B.inopinata(分自人)[1]，这4个种尚未分型。
牛种、猪种和羊种布鲁氏菌均可以引起人的布病[2]。犬种布鲁氏菌属于粗糙型菌株，主要引起犬类动物发病[3]，导致母犬流产、公犬附睾炎等，犬种布鲁氏
菌毒力较低[4]，无法引起典型的布病症状，但却可以在体内长期存在[5]，并且病犬的排泄物和流产物中可携带大量病原菌，成为传染源。由于犬也是猪种、牛种和羊种布鲁氏菌的易感动物，因此犬的布病对于公共卫生安全具有威胁。 本研究从北京某动物医院送检的4只流产或产出死胎的母犬阴道分泌物及1只患睾丸炎的公犬血液中各分离到1株布鲁氏菌。本研究结果对北京地区犬布病的监测及防控提供了实验依据。
1 材料和方法
1.1 标准菌株、噬菌体及病料样品来源 对照菌株包括 B.canisRM6/66、B.abortus2308、B.melitensis 16M、B.suis1330及噬菌体Tb均由本实验室保存。病料样品均来自北京市某动物医院就诊的38只宠物犬(编号D1～D38)，其中D1～D22为母犬，分别采集血清和阴道分泌物；D23～D24为公犬，分别采集血清和抗凝血；D25～D38只采集血清样品。
1.2 标准血清及抗原 布鲁氏菌虎红平板凝集抗原、布鲁氏菌试管凝集抗原以及布鲁氏菌标准阴阳性血清均购自中国兽医药品监察所；单因子抗血清A、M、R由本实验室制备。
1.3 主要试剂及培养基 2×TaqMaster Mix购自北京康为世纪公司；DNA Marker DL2000购自中科瑞泰(北京)生物科技有限公司；生化反应鉴定试剂购自北京陆桥技术有限责任公司；硫堇和碱性品红染料购自北京鼎国生物技术发展中心；双相血液增菌瓶购自上海普奥生物医药有限公司。 1.4 血清凝集试验
1.4.1 虎红平板凝集试验(RBT) 按标准程序操作[6]。 1.4.2 微量凝集试验(SAT) 按标准程序操作[6]。
1.5 细菌的分离培养与鉴定 1.5.1 细菌分离培养
1.5.1.1 阴道分泌物样品：将采集的样品接种在选择性培养基中，于37℃5%CO2培养，14 d后仍无细菌生长，视为阴性。
1.5.1.2 抗凝血样品：将抗凝血加入无菌双相血液增菌瓶中，同时加入5%胎牛血清、终浓度0.02%的葡萄糖，颠倒混匀防止血液凝固，于37℃5%CO2培养，30 d后无细菌生长，视为阴性。 1.5.2 细菌鉴定试验
1.5.2.1 菌体染色：将疑似菌株进行革兰染色，显微镜下观察其形态特征。 1.5.2.2 PCR鉴定：参照文献[7]设计合成引物B4/B5， B4： 5'-TGGCTCGGTTGCCAATATCAA-3'，B5：5'-CGCGCTTGCCTTTCAGGTCTG-3'，引物由北京奥美得诺公司合成。将疑似菌株进行PCR鉴定。
1.5.2.3 布鲁氏菌S/R型鉴定：将疑似菌株稀释成1×109cfu/mL的悬液作为抗原，取30 μL与0.1%吖啶黄染液等量混合，37℃反应6 h后置室温，次日观察菌体凝集情况。
1.5.2.4 种属生化鉴定：按照文献[3]的方法操作，以下试验均需设立阴性和阳性对照。
a.CO2需求试验：将布鲁氏菌分别置于5%CO2和大气环境中培养，48 h后观察是否生长。
b.H2S生成试验：将布鲁氏菌接种于H2S生化反应管内，观察生化反应管是否有褐色沉淀生成。
c.脲酶利用试验：将布鲁氏菌接种于脲酶生化反应管内，观察24 h内生化反应
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