SLeX对肝癌HepG2细胞迁移和侵袭的影响*
武文娟1△， 崔 灿2， 康品方3， 石玉荣1， 耿英华4
【摘 要】[摘 要] 目的： 探讨唾液酸化路易斯寡糖X(sialyl Lewis X， SLeX)在肝癌HepG2细胞中的表达及其对HepG2细胞迁移能力和侵袭能力的影响。方法: 实时荧光定量PCR和Western blot法检测α1,3-岩藻糖基转移酶VII (α1, 3-fucosyltransferase VII， FUT7)在HepG2细胞和L-02细胞中的表达，Western blot及免疫细胞化学染色检测SLeX在HepG2细胞和L-02细胞中表达，应用Transwell小室检测SLeX单克隆抗体封闭后HepG2细胞侵袭和迁移能力的改变。结果: FUT7和SLeX在HepG2细胞中表达，而在L-02细胞中无表达； 0.05、0.5和5 mg/L的SLeX单克隆抗体封闭后，HepG2细胞的迁移率逐渐下降，与对照组相比差异显著(P<0.05)，侵袭穿膜细胞数明显少于对照组(P<0.05)；SLeX单克隆抗体封闭组间两两比较迁移率与侵袭细胞数的差异均有统计学意义(P<0.05)。结论: SLeX在肝癌HepG2细胞中高表达，与HepG2细胞迁移能力和侵袭能力密切相关。 【期刊名称】中国病理生理杂志 【年(卷),期】2017(000)004 【总页数】6
【关键词】[关键词] 唾液酸化路易斯寡糖X； 肝细胞癌； HepG2细胞； 细胞迁移； 细胞侵袭
肿瘤细胞和内皮细胞之间的相互作用是一个重要的过程 ，它与肿瘤血管生成和血行转移密切相关，是恶性肿瘤治疗失败的常见原因之一。在此过程中肿瘤细胞与内皮细胞之间的黏附非常重要，有多种黏附分子参与，细胞黏附分子的表
达异常或功能丧失在肿瘤的转移过程中有重要作用。唾液酸化路易斯X(sialy Lewis X，SLeX)属于细胞黏附分子家族，作为E-选择素、P-选择素和L-选择素的配体，可以介导肿瘤细胞与内皮细胞的黏附作用[1]，使肿瘤细胞穿过血管内皮细胞的基底膜，促使癌细胞转移和扩散。SLeX在多种肿瘤细胞过表达[2]，参与并介导肿瘤细胞的血行转移，可能作为肿瘤预后的一个标志物。为了探讨降低或封闭SLeX的表达是否能减少肿瘤细胞的侵袭和转移，本文检测了SLeX及参与SLeX合成的关键酶 α1,3-岩藻糖基转移酶VII(α1, 3-fucosyltransferase VII，FUT7)在肝癌细胞株HepG2及正常肝细胞株L-02中表达差异，并用SLeX单克隆抗体封闭SLeX，观察其对HepG2细胞迁移能力和侵袭能力的影响。
材 料 和 方 法
1 主要材料和试剂
肝癌细胞株HepG2及正常肝细胞株L-02 由本实验诊断中心冻存；DMEM高糖培养基为Gibco产品；胰酶为Life Technologies产品；新生牛血清购自杭州四季青生物制品公司； TRIzol和DEPC购自Invitrogen；PCR试剂盒购自天根公司；Transwell小室为Corning产品；MTT和二甲亚砜(DMSO)购自Sigma；Matrigel基质蛋白和鼠抗人SLeX单克隆抗体为BD产品；FUT7羊抗人多克隆抗体和HRP标记的羊抗鼠IgG购自Santa Cruz。 2 主要方法
2.1 细胞培养 复苏冻存的肝癌细胞株HepG2和正常肝细胞株L-02，37 ℃、饱和湿度、5% CO2条件下用含10%灭活小牛血清的DMEM高糖培养基培养，每隔2～3 d传代1次。取对数生长期细胞用于实验。
2.2 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测FUT7的mRNA表达 对数生长期HepG2细胞和L-02细胞经胰酶消化，提取总RNA，逆转录合成cDNA，进行荧光定量
PCR
检测。FUT7
，
下
的上游引物序列为游
引
物
序
列
为
5’-5’-
CCACGATCACCATCCTTG-3’
AGGCTTCGGTTGGCACTC-3’；GAPDH的上游引物序列为5’-CTCCTCCACCTTTGACGCTG-3’
，
下
游
引
物
序
列
为
5’-
TCCTCTTGTGCTCTTGCTGG-3’。扩增条件为：95 ℃ 3 min； 94 ℃ 20 s、58.9 ℃ 20 s、68 ℃ 20 s，共40 个循环。GAPDH作为内参照，采用2-ΔΔCt方法分析检测结果，实验重复3次。
2.3 Western blot法检测细胞蛋白水平 对数生长期HepG2细胞、L-02细胞用胰酶消化，加裂解液裂解细胞，提取总蛋白。10% SDS-PAGE电泳分离并转膜，5%脱脂牛奶封闭孵育2 h，加入FUT7/SLeX的 I 抗(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜后用TBST漂洗3次； II 抗(1∶5 000)37 ℃孵育2 h，TBST漂洗3次，ECL显色，Bio-Rad凝胶成像仪检测条带并进行灰度值分析。
2.4 免疫组织化学染色法检测SLeX表达 处理好的细胞爬片采用免疫组织化学二步法染色观察HepG2细胞及L-02细胞中SLeX的表达。二氨基联苯胺显色，苏木素复染，以细胞(和)细胞核出现淡黄色至棕褐色颗粒为染色阳性。显微镜下随机选取5个视野(×400)，计数100个细胞中的阳性细胞数并计分：<5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。显色强度：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕色或棕褐色为3分。染色强度与阳性细胞百分比的乘积作为每种细胞的积分：0分为阴性(-)，1～4分为弱阳性(+)，5～8分为中度阳性(++)，9～12分为强阳性
SLeX对肝癌HepG2细胞迁移和侵袭的影响
