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悬浮芯片法与常规酶联免疫吸附法检测3种
兽药残留的比较
作者：刘楠 苏璞 高志贤 朱茂祥 杨陟华 潘秀颉 晁福寰 【摘要】 建立氯霉素，克伦特罗和雌二醇 3种兽药残留同时检测的悬浮芯片法。通过将3种兽药的BSA蛋白结合物偶联于悬浮芯片的固相载体——聚苯乙烯荧光微球上作为检测探针，采用间接竞争法，在液相反应体系中，3种小分子兽药抗原和微球上的兽药结合物共同竞争液相中各自特异性的生物素化单抗，再加入藻红蛋白标记的链霉亲和素，反应后检测获得荧光信号，绘制出3种兽药残留检测的标准曲线。同时进行3种兽药的常规酶联免疫吸附法标准曲线的测定。在检测技术、检出限、检测区间、特异性、盲样测定和多元分析等方面对两种方法进行比较。除了特异性外的其它指标的比较中，悬浮芯片法均具有明显优势。两种方法的特异性检测具有良好的一致性。高通量悬浮芯片技术，具有操作简单、灵敏快速和成本低廉等优点，为多种兽药残留的快速检测提供了新方法。
【关键词】 悬浮芯片， 酶联免疫吸附法， 残留， 微球， 中位荧光强度值
Abstract A novel suspension array technology was established for the detection of three kinds of veterinary drug residues: chloramphenicol, clenbuterol and 17
βestradiol.
The three conjugates in which veterinary drugs coupled with BSA were immobilized on the solid carrier of the suspension
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microarraypolystyrene fluorescent microspheres/beads as detective probes. Indirect competitive technology was employed. Competitive reactions between the veterinary drugs in the aqueous phase and the veterinary drugs
BSA conjugates on the
beads for coupling with their complimentary specific biotinylated monoclonal antibodies were carried out. And then, straptavidinphycoerythrin was added for coupling and the fluorescent signals were captured. Afterwards the detective standard curves were plotted. The regular ELISA standard curves of the three veterinary drugs were also plotted. Comparison between suspension array and regular enzyme
linked
immunosorbent assay(ELISA) was in the respects of the detective technology, the detection limits, the detective ranges, the samples detection and the multianalysis. Suspension array technology is distinct advantageous except for specificity. There was well consistent performance between the two methods. The highthroughput suspension array provides a novel method for multianalysis of veterinary drugs with simple operation, sensitive, rapid and low costing.
Keywords Suspension microarray, Enzyme
linked
immunosorbent assay, residue, microspheres beads, median fluorescent intensity
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1 引 言
近年来，食品安全已成为社会共同关注的公共卫生问题，而兽药残留成为食品安全监管的重要问题。兽药残留如克伦特罗 (clenbuterol, CL)、氯霉素(chloramphenicol, CAP)和雌二醇 (17βestradiol, E2)的滥用和食用可导致多种健康损害[1～6]。加强兽药残留检测分析是监管和控制兽药残留的重要手段。因此，简单、快速和灵敏的微痕量检测技术的研究和创新尤为重要。目前，酶联免疫吸附测定法(enzyme
linked immunosorbent assay, ELISA)[7,8]
是兽药残留的主要检测方法之一具有简单、快速、灵敏度高和特异性强等诸多优点[9]。悬浮芯片技术是一种多功能的液相芯片分析平台，既具有固态片膜芯片的高通量特性，又具有操作简便、重复性好、灵敏度高等优点。目前，对该技术的研究多集中于大分子蛋白质和核酸的检测[10～12]，并未见应用悬浮芯片同时检测多种兽药CAP、CL和E2的报道。本研究采用悬浮芯片法和常规ELISA法对3种兽药进行同时检测，并在灵敏度、特异性、检出限等方面进行比较。
2 实验部分 2.1 仪器和试剂
BioPlex悬浮系统，Model 680型酶标仪(美国BioRad公司)；MALDITOFMS REFLEXⅢ型质谱仪(德国Bruker公司)，DU530型紫外可见分光光度计 (美国Beckman公司);6930型冷冻离心机(日本Kubota公司)；MS3型旋涡混匀器(德国IKA公司)，YM10过滤柱 (孔径1.2 μm，美国Millipore公司)，Costar96孔酶标板 (美国
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Corning公司)； 日立S4500型扫描电镜 (日本Hitachi公司)。
3种不同编码的荧光微球(beads，Φ=5.6 μm)和蛋白氨基偶联试剂盒（包括激活缓冲液和储备缓冲液）购自美国BioRad公司;CAP单克隆抗体和E2单克隆抗体(美国Biodesign公司)；CL单克隆抗体 (英国Abcam公司)；3种单抗的生物素化由本实验室完成；CAP、CL、E2、EDC、SulfoNHS、沙丁胺醇、莱克多巴胺、N,N
二甲基甲酰胺
(DMF)、邻苯二胺(OPD)和E2BSA结合物(美国Sigma公司)；链霉亲和素
藻红蛋白(Straptavidinphycoerythrin, SA
PE，美国
Invitrogen公司)；BSA(德国Roche公司)； CAPBSA和CLBSA为本实验室合成。其它试剂均为国产分析纯。
2.2 实验方法
2.2.1 悬浮芯片检测微球的制备
参照试剂盒说明书，取3种荧光微球 (1.25×107 个/mL)，磷酸盐缓冲液 (PBS) 重悬后，加入到激活缓冲液中，并立即加入新鲜配制的偶联试剂EDC和SulfoNHS(浓度均为50 g/L)，室温下搅拌20 min使其活化；活化后，分别加入3种兽药的BSA结合物5 μg，并用PBS缓冲液（pH 7.4）定容至500 μL，室温下中速旋涡振荡混匀2 h，14000 g离心4 min，弃去上清液，封闭，清洗，加入储备缓冲液， 4 ℃储存。上机进行偶联确证，以便用于下一步测试。
2.2.2 3种兽药的悬浮芯片多元分析标准曲线的测定 实验采用间接竞争法，在96孔反应板的每个反应孔中分别加入优化后的3种靶标物对应的生物素化单抗5、1和16 ng，分别将CAP、
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CL和E2的标准品(以下涉及到3种兽药均按此顺序)按照5×、5×和3×梯度分别稀释成7个梯度加入。将3种荧光微球等比例混合，每孔加入3种荧光微球各2000个，并用PBS补足至50 μL/孔，同时再各准备一个不加标准品的阳性对照孔。37 ℃中速漩涡振荡2 h，使荧光微球上的兽药BSA结合物与溶液中相应的标准品共同竞争生物素化的单抗，然后加入1∶100的SAPE 50 mL/孔，37 ℃中速振荡反应30 min。悬浮芯片读取每孔100个荧光微球，获得中位荧光强度值(MFI)。以各种靶标标准品的浓度为X轴，以检测得到的MFIs为Y轴，绘制3种兽药小分子的悬浮芯片检测标准曲线。
2.2.3 3种兽药的常规ELISA标准曲线的测定
采用间接竞争法[13～15]，在酶标板上包被小分子兽药的BSA结合物，以方阵滴定法筛选和优化3种兽药常规ELISA的包被原量(分别是2、0.2和0.25 μg)和单抗工作浓度 (稀释度分别为1∶80000、1∶20000和1∶80000)，确定反应条件后，选择3种兽药标准品的浓度，绘制各自的标准曲线。
2.2.4 两种方法对3种兽药残留的特异性测试
准备3组沙丁胺醇、莱克多巴胺、庆大霉素和红霉素测试品，终浓度达到50、 1250和31250 ng/L，每个浓度平行做3个样，同时准备一个阳性对照样，悬浮芯片读数并与阳性对照样比较。以交叉反应率(CR%)测试常规ELISA检测的特异性。
2.2.5 3种兽药盲样的检测比较
准备3个浓度的3种兽药盲样，交由测试者进行检测，每个
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悬浮芯片法与常规酶联免疫吸附法检测3种兽药残留的比较
