红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验
流感病毒表面得血凝素(ＨＡ)蛋白,含有识别与结合宿主细胞表面受体得结构，能使一些特定得红细胞发生凝集现象.当红细胞与病毒按适当得比例混合后，由于病毒得作用使红细胞发生凝集,此为凝集现象。含有特异得抗流感病毒HA蛋白得抗血清，能抑制红细胞凝集现象得出现,即抗体与病毒结合后，可以使血凝素不能吸附于红细胞表面得受体上,此为红细胞凝集抑制（HＡI).
微量红细胞凝集抑制试验就是目前最常用得一种鉴定流感病毒型／亚型及分析流感病毒HA抗原性变异得试验方法,也可以用于对一般人群抗体水平得检测与疫苗效果得评价等方面。
用于HAI试验得标准参照血清必须及时更新,用于鉴定流感病毒型/亚型应包括当年得国际疫苗株或国内流行代表株得抗血清,可以用羊、鸡、雪貂、兔等实验动物得抗血清；用于抗原分析得抗血清建议包括同一型别与亚型不同毒株免疫得标准参考抗血清,由于用雪貂制备得抗流感病毒血清特异性高,易将不同毒株间抗原性差异显示出来,因此常用免疫雪貂得抗血清进行抗原分析。HＡI试验中所用得血清必须经特殊处理以去除非特异性抑制素及非特异性凝集素。
(一）生物安全要求
所有有关试验操作都应在相应生物安全级别得实验室中进行，必须遵守生物安全规定，严格执行标准操作规程与废弃物管理规定，做好个人防护要求。季节性流感病毒病毒或经完全灭活得高致病性禽流感病毒操作可以在BSL—2实验室里进行，高致病性禽流感病毒得操
作在BＳＬ—3级实验室中进行。
（二)实验所用试剂
1。标准参考抗原:以国际疫苗株与国内流行株作为标准参考抗原,新分离得毒株作为待测抗原。
2. 标准参考抗血清:以国际疫苗株与国内流行株制备得抗血清作为标准参考血清。血清要经ＲＤE处理。 （三)其她试剂/材料/仪器 1. 红细胞悬液
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2. PH７、4得PＢS缓冲液 3. RDＥ（日本生研） 4. 水浴箱（3７℃,5６℃) 5. 台式离心机
6. 多道可调加样器、单道可调加样器 7. 离心管
8. 96孔微量血凝板(使用豚鼠与人红细胞进行实验须用“Ｕ\底板,使用火鸡红细胞进行实验用“V”底板) 9. ２０0μL、１000μLTIP头、水槽
表１、 流感病毒红细胞凝集试验各项条件比较
红细胞 终浓度 孔底部形状 孵育时间
火鸡 ０、5 V型 25-30min
豚鼠 0、５ Ｕ型 ４5—６０mｉｎ
人“O\型血 0、5 Ｕ型 ４5—60min
???
细胞沉积成点状，倾
红细胞沉积形状
斜时细胞向下流成泪
滴状
细胞沉积成环状
细胞沉积成环状
（四)流感病毒鉴定与抗原分析步骤 1. 实验前准备
（1） 标准参考抗血清得处理 1）
去除血清中得非特异性抑制素
a） 所谓抑制素就是指各种动物血清、体液、组织液中所含与红细胞表面受体相似得物质,它们能与红细胞受体一起竞争性地被病毒表面血凝素所识别与结合。目前所知道得非特异性抑制素,除大白鼠血清中对丙型流感病毒特殊得非特异性抑制素,还有三种:α、β与γ。在ＨAI试验中,必须将非特异性抑制素从抗血清中去除干净,才能准确地测定出ＨAI得抗体效价。常用得清除非特异性血凝抑制素得方法有霍乱滤液（RＤE,受体破坏酶得一种)清除法,过碘酸钾清除法等。
b） RＤE处理步骤:用２5mL生理盐水稀释RＤE；在1体积血清中加入3体积RDＥ（如0、１mＬ血清+０、３mLRDE),37℃水浴１6-18ｈ;５6℃水浴30 min；加入6体积生理盐水(在０、４mL RDＥ与血清混合物中加入0、6mＬ生理盐水)。 2）
去除非特异性凝集素
a） 向20体积RDE处理后得血清中加入1体积得纯血球。
b） 完全/彻底混匀,在2—8℃孵育，每15 ｍin重新混匀一次。
c） 1ｈ后，20０0转离心5min。吸出血清上清液。 d） 取出一块9６孔血凝板，在第一列每孔加入５0uLPBＳ缓冲液,吸出５0uL处理好得血清，做2倍稀释,加入50uL红细胞悬液,室温静置３0—６0ｍin,观察试验结果,如果红细胞沉积,证明血清中非特异性凝集素去除干净(去除非特异性凝集用红细胞类型与下一步试验用红细胞类型一致）。
（2） 红细胞悬液配制 1）
A、S液全称为Alsｅveｒ氏液。配制方法为葡萄糖2、0
５ｇ、柠檬酸钠0、8g、柠檬酸0、0５5g、氯化钠０、42g、去离子水加至１00mL,微热溶解,将ｐH值调到６、1,8磅20ｍｉn高压灭菌，4℃贮存备用。 2）
将含有红细胞得A、S液,离心5min（火鸡/鸡红细胞１
800rpm;人“O”型、豚鼠红细胞2000rpm，不同离心机转速稍有不同)，弃上清。 3）
加入等量得ＰBS缓冲液洗涤,充分混匀,离心５mｉｎ
（转速同上),弃上清. PBＳ缓冲液洗涤三次．最后一次洗涤后，离心10ｍiｎ(转速同上),弃上清。 4）
吸出适当体积得红细胞，用ＰＢS缓冲液配制成工作浓
度为1%红细胞悬液。
2. 流感毒株ＨA滴度得测定
（1） 在微量血凝板得第２~12列加入50μL ＰBS缓冲液。 （2） 在第一列（A1～G１)中加入１00μL病毒悬液. （3） H１加入10０μL PＢS,作为红细胞阴性对照。
（4） 从第一列各孔吸50μL病毒液，由第1列至第１2列做２倍系列稀释，最后一列每孔弃去5０μＬ。
（5） 在每孔中加入50μL红细胞悬液,轻拍血凝板,充分混匀。 （6） 室温孵育，鸡与火鸡红细胞静置25-30miｎ后观察结果,人“O＂型与豚鼠红细胞45—６0ｍin后观察结果,并记录。 3. HA试验结果判断
引起全部红细胞凝集为完全凝集,以“＋”记录;只有部分红细胞凝集记录为“+/—\无凝集记录“—”。血凝滴度得判定以出现完全凝集得最高稀释度为终点,其稀释度得倒数即为病毒得血凝滴度。
表2、 HA滴度判定举例
A B
1:1 1 + +
1:2 2 + + + + +
1：1:4 3
8 4
病毒稀释度
1：11:３１:6６ 5 — — + ＋ + ＋ +
2 6 - — — + + + +
４ 7 — — — — + + +
1:12８ 8 - — － — - + +
1:256 9 － - － - — - +
１:51１:1022 10 - - — — — - +
4 １１ — — — — — - +
1:2048 １2 — — - — － — +
ＨＡ滴度 2 ８ 16 ３2 64 1２8 ≥２04
－ — + + + + + +
＋ ＋ + + + +
Ｃ + D
+
E ＋
F ＋ ＋ G
+
+
红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验
