M6A修饰在mRNA中的作用
摘要：N6-甲基腺苷（m6A）是最丰富的mRNA内部修饰之一，它影响与真核mRNA相关的多个生物学过程。在多次实验中发现注射质粒比注射mRNA的表达量高，为了探究这种现象背后的原因，我们查阅了相关文献，并提出猜测即体外合成的mRNA相比体内合成的mRNA没有经过修饰，因此为了进一步验证这种假设我们将继续进行实验验证。
关键字：m6A修饰 mRNA 1.前言
有研究表明m6A修饰主要发生在RRACH（R = G或A，G> A，H = A或C或U，U> A> C）序列的腺嘌呤（A）上， m6A修饰可调节RNA代谢，包括可变剪接，可变聚腺苷酸化，mRNA输出，衰减，稳定和翻译。m6A代谢途径受一系列m6A 编码器，擦除器，读码器调节。并且主要位于终止密码子和3’非编码区附近的mRNA上。在哺乳动物中，约0.1％至0.6％的腺嘌呤经过m6A修饰，每个mRNA中平均有3至5个甲基化位点。与DNA甲基化相似，RNA中的m6A水平也是动态可逆的。已经发现了许多甲基转移酶复合物（MTC），METTL3，METTL14 等，脱甲基酶FTO，ALKBH5等（图1）。m6A修饰相关的甲基化酶可以受转录，转录后和翻译调控中涉及的多种因素调控。m6A修饰可以以组织和细胞类型特异性的方式沉积在转录本上，也就是不同的酶在不同的区域有不同的偏好。目前发现了一些m6A修饰调节剂，例如ZFP217，SMAD2/3，CEBPZ，TARBP2和TRA2A等。它们以细胞类型特异性方式募集或排斥MTC来调节mRNA的m6A修饰。到目前为止，已经发现了三类m6A 阅读器：第一类包含YTH结构域的蛋白质，可以调节mRNA的衰减。第二类，RNA结构依赖性蛋白，包括HNRNPC/G和HNRNPA2B1。第三类，RNA结合蛋白，如IGF2BP1/2/3，FMRP等可以调节mRNA的稳定性。
有研究表明大多数m6A读码器和擦除器位于核中，表明它们可能调节RNA加工。 此外也有研究表明m6A修饰在干细胞命运决定和分化中起着非常重要的的作用。最近有研究表明RNA的 m6A修饰对于神经系统的发育和功能维持是必不可少的。因此可见对m6A修饰的研究对生命现象的探究和生物医药的发展以及再生医学疾病治疗中都有非常重要的作用。
图1 与m6A修饰相关的一些酶
2.实验材料
vrtn-GFP-PCS2质粒 斑马鱼胚胎 3.实验方法 3.1体外转录mRNA
3.2将体外转录的mRNA和质粒注射进斑马鱼的一细胞胚胎中，注射后12小时观察荧光。
图3.2-1注射20pg质粒 图3.2-2注射100pg mRNA
expression120100806040200plasmid 20 pgRNA 100 pg 表3.2-1 GFP的定量表达
3.3提取注射质粒和mRNA 24小时后的胚胎中的mRNA。 3.4将mRNA纯化后反转录成DNA。 3.5作qPCR。
qPCR结果表明随着胚胎的生长注射进去的mRNA逐渐降解，而注射进去的质粒随着胚胎的生长转录成mRNA的量逐渐增多，在24小时左右差别不太明显，与预期结果相符，后期需要对注射后的各个时期进行mRNA的提取，反转录以及作qPCR并作直线图。
21.510.50RNA表3.5-1 定量PCR结果
plasmid 3.6定点突变
通过vrtn的Rip-seq找到了vrtn的主要m6A修饰位点，并决定对该位点进行定点突变，即将GAC突变为GCC,GGC以及直接删除GAC,并构建质粒，计划将突变的质粒和原质粒分别注射进斑马鱼的胚胎中，并观察荧光和经行qPCR定量分析，后续工作还未完成。
参考文献：
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