吡咯烷二硫代氨基甲酸盐抑制胆固醇诱导的
人肝细胞C反应蛋白的表达
作者：唐俊利，徐海燕，刘喜平，钱民章
【摘要】 目的 研究核因子κB(NF-κB)信号通路阻断剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)对胆固醇诱导的人肝细胞C反应蛋白(C-reactive protein, CRP)表达的影响。方法 培养肝细胞L-02并将其分为3个组，即胆固醇作用组、PDTC+胆固醇作用组和对照组，分别作用细胞48 h。采用Western blot和免疫比浊法分别检测细胞内和细胞培养液中CRP含量，比较有无PDTC作用下CRP表达量的变化。结果 胆固醇能显著诱导人肝细胞C反应蛋白的表达(P<0.05)，且其诱导效应随浓度增加而增强；加入PDTC阻断NF-κB信号通路后，胆固醇诱导人肝细胞CRP基因表达的作用减弱(P<0.05)。结论 PDTC阻断NF-κB信号通路后，CRP表达量下降，提示NF-κB信号通路可能参与了胆固醇诱导CRP基因表达的过程。
【关键词】 C反应蛋白；胆固醇；动脉粥样硬化；核因子κB
ABSTRACT: Objective To study the effects of PDTC on cholesterol induced C-reactive protein gene expression in L-02 cell line. Methods Human hepatocyte cell line L-02 was cultured in vitro; growth-arrested cells were divided into 3 groups,
cholesterol group, PDTC+cholesterol group and control group. After 48 h incubation, western blot and immunoturbidimetry assays were carried out to detect intracellular and secreted C reactive protein expression. Results Cholesterol stimulated CRP gene expression in L-02 (P<0.05) compared with negative control group; After PDTC application, CRP gene expression in all the cholesterol dosage groups (at 6.25 mg/L, 12.5 mg/L, 25.0 mg/L, 50.0 mg/L, respectively) decreased significantly. Conclusion Cholesterol induced L-02 CRP gene expression. CRP gene expression decreased significantly after PDTC application，which indicates that NF-
κB might be involved in the cholesterol induced C-reactive protein gene expression in L-02 cell line.
KEY WORDS: C reactive protein; cholesterol;
atherosclerosis; nuclear factor kappa B(NF-κB)
动脉粥样硬化(atherosclerosis, As)的发病机制仍不完全清楚。脂质浸润学说认为As的发生与脂质代谢紊乱密切相关，胆固醇在As病变形成中起着重要作用，是致As的因素之一［1］。Ross教授［2］在其损伤反应学说的基础上明确提出“动脉粥样硬化是一种炎症性疾病”。C反应蛋白(C-reactive protein, CRP)作为一种急性期反应蛋白，其水平增高是体内炎症的敏感指标。有研究发现CRP直接参与了动脉粥样硬化的发生和发展［3-5］。近年来的研究发现，血脂水平与血清CRP水平之间有着密切的关系。Ridker等［6］报道，血清总胆固醇升高时CRP也升高；Verhamme等［7］用减低脂质含量的饲料喂养高脂血症的幼猪，4周后发现血脂和血清CRP水平都有显著降低，高胆固醇血症与血清CRP水平升高关系密切，但具体机制尚不明确。在本研究中，我们观察了胆固醇对体外培养的人肝细胞L-02 CRP基因表达的影响，并在此基础上采用核因子
κB(NF-κB)信号通路的阻断剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)作用细胞，观察NF-κB信号通路是否参与了胆固醇诱导人肝细胞CRP基因表达的过程。
1 材料与方法
1.1 细胞及主要试剂
L-02细胞株由武汉大学细胞保藏中心提供。RPMI-1640培养基购自Gibco公司；胎牛血清、CRP免疫比浊试剂盒购自华美公司；胆固醇、PDTC购自Sigma公司；CRP标准品、IL-6等购自晶美公司；山羊抗人CRP一抗、兔抗人actin一抗购自Santa Cruz。
1.2 L-02细胞的培养
L-02细胞按常规方法培养。消化计数后以1×106个/mL的密度种于6孔板，每孔用2 mL含10%(体积分数)FBS的RPMI-1640培养基培养24 h后，换1 mL无血清RPMI-1640培养基培养24 h，后按实验分组情况对细胞进行处理。
1.3 实验分组及处理
实验分为3组：胆固醇作用组分别以6.25(ch1)、12.5(ch2)、25.0(ch3)、50.0(ch4)mg/L 的胆固醇作用人肝细胞L-02；PDTC+胆固醇作用组采用100 μmol/L PDTC预处理细胞60 min，后分别以6.25、12.5、25.0、50.0 mg/L的胆固醇作用人肝细胞L-02；阳性对照使用质量浓度为50 μg/L的IL-6作用人肝细胞L-02，阴性对照组采用1% (体积分数)FBS的RPMI-1640加0.2%(体积分数)无水乙醇作用人肝细胞L-02。各组作用细胞48 h后收集细胞培养液及细胞。
1.4 Western blot检测肝细胞L-02内CRP的表达
细胞经药物作用48 h后，吸出细胞培养液，用PBS冲洗细胞，再加入细胞裂解液裂解细胞，提取胞内总蛋白，小部分用Lorry氏法测定蛋白浓度。经电泳、电转、封闭后分别与CRP及actin的一抗和二抗作用，最后采用化学发光法检测目的条带，用图像分析仪拍照并测定各显色条带的吸光度。以各组CRP/actin吸光度的比值计为CRP
吡咯烷二硫代氨基甲酸盐抑制胆固醇诱导的人肝细胞C反应蛋白的表达
