DNA分子标记技术在物种鉴定和系统分析中的应用
——草坪草的RAPD分子标记
一、溶液配制及物品准备
所有水均使用超纯水116室，如果没有则用去离子水。 1. 配制1 M Tris-HCl (pH8.0) 【100mL】-蓝盖瓶装
配方:
1 M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)
1. 称量121.1 g Tris置于1 L烧杯中。 2. 加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3. 按下表量加入浓盐酸调节所需要的pH值。
PH值7.47.68.0 浓HCl约70ml约60ml约42ml 4. 将溶液定容至1 L。
5. 高温高压灭菌后，室温保存。
注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。
2. 配EDTA（0.5 mol/l pH8.0）【500mL】-蓝盖瓶装
配方:
EDTA（0.5 mol/l pH8.0）
(1)称取93.06克EDTA·2Na·2H2O，置于500 mL烧杯中 (2)加入约400 mL dd H2O.用热磁力搅拌器充分搅拌 (3)用NaOH调节pH值到8，约用10克固体NaOH (4)在溶液冷却后，再用NaOH调节至pH=8 (5)加dd H2O将溶液定容到500 ml (6)高温高压灭菌后，室温保存
EDTA二钠盐难溶，需加入NaOH将溶液的pH值调至接近8.0时才会溶解。配制时，可以直接将EDTA·2Na·2H2O和约10g的NaOH （注意约10g，不要一次加到10g，为后面pH微调留下余地）一起加水混合，充分溶解，再微调pH。
3. 1×TE Buffer 储存液【1L】-烧杯配制，锥形瓶分装
分装至500mL锥形瓶中，250mL/瓶，分成4瓶。灭菌备用。
配方
组份浓度 10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA（pH8.0） 1. 量取下列溶液，置于1L烧杯中。
1 M Tris-HCl Buffer（pH8.0） 10mL 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 2mL
2. 向烧杯中加入约800mL的去离子水，均匀混合。 3. 将溶液定容至1L。
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4. 高温高压灭菌，室温保存。
将1-3的溶液配好后，再统一灭菌，保存。
4. 准备灭菌水（500 mL蓝盖瓶装）1瓶，黄枪头，蓝枪头，白枪头，进口1.5 mL
离心管2盒，普通1.5 mL离心管2盒，普通4 mL离心管2盒，PCR小指管200 μl 2盒，灭菌，保存。
每次实验完毕后，各小组将灭菌水1瓶，黄枪头，蓝枪头，白枪头，进口1.5 mL离心管2盒，PCR小指管200 μl 2盒，重新装满，灭菌后，放在120南面的实验架上。
5. 电泳缓冲液：【随用随配】
5×TBE（贮存液/L室温保存）【500mL】 54 g Tris碱 27.5 g硼酸
20ml 0.5mol/L EDTA（pH 8.0）
0.5×TBE（工作液）
注意：实验用药品在天平上方的架子上，其他需要4℃保存的药品等，放置在120室透明门冰箱最底层。需要-20 ℃保存的药品，染料，引物等在119室1号冰箱下层冷冻室的第一个抽屉中。配好的试剂，如需要存放，写好标签，放在对应冰箱中。用后归位！
二、草坪草基因组DNA的提取
草坪草提前两至三周种植，当草坪草的生长到了比较茂盛的阶段，即可进行基因组DNA的提取。使用天根新型植物基因组提取试剂盒(DP320)，操作步骤如下：
1. 处理材料：清洗研钵及研磨棒，晾干或烘干，液氮预冷。取草坪草新鲜叶子
组织100 mg 加入液氮充分研磨。加入400 μl缓冲液LP1和6 μl RNase A（10 mg/ml），漩涡震荡1 min，室温放置10 min。
要求：每一大组4种植物，每种提取4份，共16小管。同一种植物可以取1g-1.5g一次研磨，再分成4份，分别处理。 2. 加入130 μl缓冲液LP2，充分混匀，漩涡震荡1 min。
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3. 12000 rpm（~13400 g）离心5min，将上清移至新的离心管中。
4. 加入1.5倍体积的缓冲液LP3（使用前检查是否已加入无水乙醇），立即充
分振荡混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀。
5. 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集
管中），12000 rpm（~13400 g）离心30 s，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。
6. 向吸附柱CB3中加入700 μl漂洗液PW（使用前检查是否已加入无水乙醇），
12000 rpm（~13400 g）离心30 s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
注意：如果吸附柱呈现绿色，向吸附柱CB中加入500 μl无水乙醇，12000 rpm（~13400 g）离心30 s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 7. 重复步骤6
8. 将吸附柱CB3放回收集管中，12000 rpm（~13400 g）离心2min，倒掉废液。
将吸附柱CB3助于室温放置数分钟，彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。（漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应实验）
9. 将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100
μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12000 rpm（~13400 g）离心2min，将溶液收集到离心管中。
要求：将同种植物的4份混合至1个离心管中，标号，封口处加贴封口膜。放入-20℃冰箱中长期保存，或者直接进行下一步电泳鉴定。
注意事项：
1. 检查LP1，LP2是否有沉淀，如有，37℃水浴化开，或微波十秒左右化开（微
波时注意安全，化开即可，可短时多次）
2. 研磨样品时，一定要在植物冻住的状态下研磨。如果化开，一定要及时加液氮，
切勿在糊状下继续研磨，液氮添加次数至少3次。
3. 磨好的样品，转移到每个离心管中不要过多。研磨的是过量的，每个1.5mL离
心管中放置相当新鲜时的100mg或略多一点的样品即可。过多裂解不完全，反而提取不出或者效果不佳。
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RAPD实验方案
