第二十章 高效液相色谱法
思考题和习题
1． 简述高效液相色谱法和气相色谱法的主要异同点。
相同点：均为高效、高速、高选择性的色谱方法，兼具分离和分析功能，均可以在线检测 不同点：
GC 分析对象及范围 流动相的选择 操作条件 加温常压操作 流动相为有限的几种“惰能气化、热稳定性好、且沸性”气体，只起运载作用，对点较低的样品，占有机物的20% 组分作用小 溶解后能制成溶液的样品，流动相为液体或各种液高沸点、高分子量、难气化、离体的混合。它除了起运载作用HPLC 子型的稳定或不稳定化合物，占外，还可通过溶剂来控制和改有机物的80% 进分离。 室温、高压下进行
2．何谓化学键合相？常用的化学键合相有哪几种类型？分别用于哪些液相色谱法中？
采用化学反应的方法将固定液键合在载体表面上，所形成的填料称为化学键合相。优点是使用过程不流失，化学性能稳定，热稳定性好，适于作梯度淋洗。
目前常用的Si-O-Si-C型键合相，按极性分为非极性，中等极性与极性三类。①非极性键合相：常见如ODS键合相，既有分配又有吸附作用，用途非常广泛，用于分析非极性或弱极性化合物；②中等圾性键合相：常见的有醚基键合相，这种键合相可作正相或反相色谱的固定相，视流动相的极性而定：③极性键合相：常用氨基、氰基键合相，用作正相色谱的固定相，氨基键合相还是分离糖类最常用的固定相。
3．什么叫正相色谱？什么叫反相色谱？各适用于分离哪些化合物？
正相色谱法：流动相极性小于固定相极性的色谱法。用于分离溶于有机溶剂的极性及中等极性的分子型物质，用于含有不同官能团物质的分离。
反相色谱法：流动相极性大于固定相极性的色谱法。用于分离非极性至中等极性的分子型化合物。
4．简述反相键合相色谱法的分离机制。
典型的反相键合色谱法是用非极性固定相和极性流动相组成的色谱体系。固定相，常用十八烷基（ODS或C18）键合相；流动相常用甲醇-水或乙腈-水。非典型反相色谱系统，用弱极性或中等极性的键合相和极性大于固定相的流动相组成。
反相键合相表面具有非极性烷基官能团，及未被取代的硅醇基。硅醇基具有吸附性能，剩余硅醇基的多寡，视覆盖率而定。对于反相色谱的分离机制目前，保留机制还没有一致的看法，大致有两种观点，一种认为属于分配色谱，另一种认为属于吸附色谱。分配色谱的作用机制是假设混合溶剂（水十有机溶剂）中极性弱的有机溶剂吸附于非极性烷基配合基表面，组分分子在流动相中与被非极性烷基配合基所吸附的液相中进行分配。吸附色谱的作用机制可用疏溶剂理论来解释。这种理论把非极性的烷基键合相，看作是在硅胶表面上覆盖了一层键合的十八烷基的\分子毛\，这种\分子毛'有强的疏水特性。当用水与有机溶剂所组成的极性溶剂为流动相来分离有机化合物时，一方面，非极性组分分子或组分分子的非极性部分，由于疏溶剂作用，将会从水中被＂挤＂出来，与固定相上的疏水烷基之间产生缔合作用，其结果使组分分子在固定相得到保留。另一方面，被分离物的极性部分受到极性流动相的作用，使它离开固定相，减小保留值，此即解缔过程，显然，这两种作用力之差，决定了分子在色谱中的保留行为。一般说来，固定相上的烷基配合基或被分离分子中非极性部分的表面积越
大，或者流动相表面张力及介电常数越大，则缔合作用越强，分配比k'也越大，保留值越大。不难理解，在反相键合相色谱中，极性大的组分先流出，极性小的组分后流出。
5．离子色谱法、反相离子对色谱法与离子抑制色谱法的原理及应用范围有何区别？
离子色谱法(Ion Chromatography) ：用离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动相。以电导检测器为通用检测器。试样组分在分离柱和抑制柱上的反应原理与离子交换色谱法相同。离子色谱法是溶液中阴离子分析的最佳方法，也可用于阳离子分析。
反相离子对色谱法(IPC或PIC) ：反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分与其中的反离子形成中性离子对，增加k和tR，以改善分离。适用于较强的有机酸、碱。
反相离子抑制色谱：在反相色谱中，通过加入缓冲溶液调节流动相pH值，抑制组分解离，增加其k和tR，以达到改善分离的目的。适用于极弱酸碱物质（pH=3~7弱酸；pH=7~8弱碱；两性化合物）
6．亲和色谱的分离机制是什么？有何特点？
传统的观念认为亲和色谱是基于配基-配体亲和反应的原理，利用色谱的差速迁移理论，实现对目标分子的分离，仅仅是一种组分分离的选择性过滤法。然而，这一理论是建立在配基-配体亲和作用是均相反应和宏观平衡态热力学的基础上的。但是，实际上目标分子在两相间分配系数过大，且在固定相上的吸附等温线多不呈线性。所以，关于生物大分子在亲和色谱中的保留机制及色谱过程数学模型的研究一直是一个相对薄弱的环节，有待进一步的完善.
亲和色谱具有较高的专属性，经其分离，纯化，浓集后的生物样品具有较高的纯度，大大降低了后续测定(如HPLC)时的背景噪音，进而使得后续测定具有极高的灵敏度。
7．速率理论方程式在HPLC中与在GC中有何异同？如何指导HPLC实验条件的选择？
解:液相色谱中引起色谱峰扩展的主要因素为涡流扩散、流动的流动相传质、滞留的流动相传质以及柱外效应。
在气相色谱中径向扩散往往比较显著，而液相色谱中径向扩散的影响较弱，往往可以忽略。另外，在液相色谱中还存在比较显著的滞留流动相传质及柱外效应。
在高效液相色谱中，对液液分配色谱，Van Deemter方程的完整表达形式为
由此，HPLC的实验条件应该是：①小粒度、均匀的球形化学键合相；②低粘度流动相，流速不宜过快；③柱温适当。
8．试讨论影响HPLC分离度的各种因素，如何提高分离度？
(1) 色谱填充性能
液相色谱柱分离性能的优劣，是由固定相粒度、柱长、由柱内径和填充状况决定的柱压降这三个参数度决定的。这三个参数度也决定了样品组分的保留时间，保留时间不仅与色谱过程的热力学因素k有关，还直接与决定柱效与分离度的柱性能参数及流动相的黏度有关，这些参数都是影响色谱分离过程动力学的重要因素。但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般都是购买商品柱，很少自行制备。
(2) 流动相及流动相的极性
液相色谱中，改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接因素。液相色谱不可能通过增加柱温来改善传质。因此大多是恒温分析。流动相选择在液相色谱中显得特别重要，流动相可显著改变组分分离状况。
(3) 流速
流速大于0.5 cm/s时， H～u曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。
9．试讨论反相HPLC的分离条件的选择。
反相HPLC法是以表面非极性载体为固定相，以比固定相极性强的溶剂为流动相的—种液相色谱分离模式。反相HPLC色谱中样品的保留值主要由固定相比表面积、键合相种类和浓度决定，保留值通常随链长增长或键合相的疏水性增强而增。溶质保留值与固定相表面积成正比，当其他条件相同时，溶质在低表面积色谱柱上的保留值短。样品的保留值也可以通过改变流动相组成或溶剂强度来调整，溶剂强度取决于有机溶剂的性质和其在流动相中的浓度。
10．在正、反相HPLC中流动相的强度是否相同？
在正相色谱中，由于固定相是极性的，所以溶剂极性越强，洗脱能力也越强，即极性强的溶剂是强溶剂。在反相色谱中，由于固定相是非极性的，所以溶剂的强度随溶剂的极性降低而增加，即极性弱的溶剂是强溶剂。
11．什么叫梯度洗脱？它与GC的程序升温有何异同？
在一个分析周期内，按一定程序不断改变流动相的组成或浓度配比，称为梯度洗提。是改进液相色谱分离的重要手段。
梯度洗提与气相色谱中的程序升温类似，但是前者连续改变的是流动相的极性、pH或离子强度，而后者改变的温度。程序升温也是改进气相色谱分离的重要手段。
12．蒸发光散射检测器的原理及特点是什么？
蒸发光散射检测器（Evaporative Light-scattering Detector）是通用型检测器，可以检测没有紫外吸收的有机物质，如人参皂苷、黄芪甲苷等。 一、ELSD原理
恒定流速的色谱仪（高效液相、逆流色谱、高效毛细管电泳等）洗脱液进入检测器后，首先被高压气流雾化，雾化形成的小液滴进入蒸发室(漂移管，drift tube)，流动相及低沸点的组分被蒸发，剩下高沸点组分的小液滴进入散射池，光束穿过散射池时被散射，散射光被光电管接收形成电信号，电信号通过放大电路、模数转换电路、计算机成为色谱工作站的数字信号——色谱图。 二、特点
1．洗脱液需要雾化，所以雾化气流的纯度和压力会影响检测器的信噪比。
2．流动相要蒸发掉，所以不能使用不易挥发的物质来调节流动相的pH值。可以通过蒸发温度的调节来使比被测物质沸点低的组分蒸发。在不使被测物质蒸发的前提下，温度越高，流动相蒸发越完全，色谱图基线越好、信噪比越高。如果被测物质沸点接近或低于流动相的蒸发温度，则无法检测；不过，100%的水做流动相，蒸发室温度也才设为150摄氏度，沸点比水低的有机物质完全可以用气相色谱仪进行分离检测了。由于流动相和溶剂蒸发了，使用ELSD检测器收集的色谱图一般没有溶剂峰；而且梯度洗脱没有折光视差效应，一般不会出现基线漂移。
3.检测光散射变化，所有进入到散射池的物质都可被检测，而且响应值只与物质的量有关。 4.浓度跟峰面积不成线性，分别取自然对数后成线性。 13．常用的HPLC定量分析方法是什么？哪些方法需要用校正因子校正峰面积？哪些方法可以不用校正因子？
常用的HPLC定量分析方法有：
外标法：外标工作曲线法、外标一点法、外标二点法等
内标法：内标工作曲线法、内标一点法、内标二点法、内标对比法等
使用内标和外标标准曲线法时，可以不必测定校正因子，其它方法须要用校正因子校正峰面积
14．指出苯、萘、蒽在反相色谱中的洗脱顺序并说明原因。
三者极性顺序从大到小是苯、萘、蒽，因此在反相色谱中的洗脱顺序为苯、萘、蒽，苯最先出峰。 15．宜用何种HPLC方法分离下列物质？ （1）乙醇和丁醇；（2）Ba2+和Sr2+；（3）正戊酸和正丁酸；（4）高摩尔质量的葡糖苷。 （1）正相键合相色谱法 （2）离子交换色谱法 （3）离子对色谱法 （4）空间排阻色谱法 16．欲测定二甲苯的混合试样中对-二甲苯的含量。称取该试样110.0mg，加入对-二甲苯的对照品30.0
'mg，用反相色谱法测定。加入对照品前后的色谱峰面积(mm2)值为，对-二甲苯：A对 40.0，A对104.2；
间-二甲苯：A间141.8，A间156.2。试计算对-二甲苯的百分含量。 （20.0%）
'm对??m对A对/A间40.0/141.8?30.0??22.1(mg)??A对/A间?A对/A间104.2/156.3?40.0/141.8
?对%?22.1?100%?20.10.017．计算例2中炔雌醇的校正因子及含量。 （3.02, 0.0369mg/片）
m炔/A炔0.035?10/(2.442?106)f炔???3.025ms/As0.0733?10/(6.578?10)A炔2.442?106 试样含炔雌醇的量m炔?f炔?ms??3.02?0.0733?10??As6.578?105m每片含炔雌醇的量炔?60.3?0.0369(mg/片)732.818．测定黄芩颗粒中的黄芩素的含量，实验方法同例1。测得对照品溶液（5.98 μg/ml）和供试品溶液的峰面积分别为：706436和458932，求黄芩颗粒中黄芩素的含量。 （1.55%）
A试C对?10?6?10?504589325.98?10?6?10?50?黄芩素%?????100%?1.55%
A对0.12557064360.125519．测定生物碱试样中黄连碱和小檗碱的含量，称取内标物、黄连碱和小檗碱对照品各0.2000g配成
混合溶液。测得峰面积分别为3.60, 3.43和4.04cm2。称取0.2400g内标物和试样0.8560g同法配制成溶液后，在相同色谱条件下测得峰面积为4.16, 3.71和4.54cm2。计算试样中黄连碱和小檗碱的含量。
（黄连碱26.2%，小檗碱27.3%）
用校正因子法计算m/AA3.60f黄?黄黄?s??1.05ms/AsA黄3.43A3.60f小?s??0.891A小4.04(C%)黄?(C%)小?A黄?f黄ms3.71?1.050.2400????100%?26.2%Asm4.160.8560A小?f小ms4.54?1.050.2400????100%?27.3%Asm4.160.8560
20．计算在反相色谱中甲醇-乙腈-水(60:10:30)的强度因子。如果改用四氢呋喃-甲醇-水，水的含量不
变，为了保持相同洗脱强度，甲醇的比例是多少? (2.12，68.7%)
S混?S甲?甲?S乙?乙?S水?水?3.0?0.60?3.2?0.10?0?0.30?2.12水含量不变,设改变溶剂后,甲醇的比例是X,则3.0?X?4.5?(0.7?X)?0?0.30?2.12X?0.687?68.7!．用15cm长的ODS柱分离两个组分。柱效n=2.84×104m–1；测得t0=1.31min；组分的tR1?4.10min；
tR2=4.45min。(1)求k1、k2、α、R值。(2)若增加柱长至30cm，分离度R可否达1.5?
((1)k1=2.13、k2=2.40、α=1.13、R=1.33，(2)R=1.88，能)
'tRt?t4.10?1.31k1?1?R10??2.13t0t01.31'tRt?t4.45?1.31k2?2?R20??2.40t0t01.31??k22.40??1.13k12.132.84?104?0.151.13?12.40???1.3341.131?2.40
n??1kR???2?4?1?k22R12L11.330.15?,?,R2?1.8822R2L2R20.30增加柱长至30cm分离度能达到1.5
高效液相色谱法习题答案
