实验十一 产蛋白酶芽孢杆菌的分离（一） ———芽孢杆菌的分离
一、目的和要求
1. 学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生菌的筛选方法。 2. 学习和掌握芽孢杆菌的分离技术。 二、实验原理
芽孢杆菌于芽孢具有较强的抗高温能力，分离纯化时可采用热处理的方法，即通过高温加热杀死其中不生芽孢的菌种，使耐热的芽孢菌得到富集。许多芽孢杆菌能分泌分泌蛋白酶，淀粉酶，可以选择酪蛋白或淀粉为主要营养成分的分离培养基，因菌体分泌的酶可以将大分子的蛋白或淀粉水解而在菌落周围形成透明圈。根据透明圈直径(H)和菌落直径(C)之比值(H/C)可以初步确定酶活力，其比值越大，酶活力越高，进而可筛选出高产酶活的菌株。 三、实验器材
1. 土壤样品：从地表下10~15cm的土壤或者枯枝烂叶，腐烂稻草中用无菌小铲，纸袋取土样，并记录取样的地理位置、pH、植被情况等(学生自取)。家畜饲养、屠宰等动物性蛋白丰富的地点土壤中筛选高产蛋白酶菌株的概率更大，若条件许可，建议尽量选择这样的地点进行采样。
2. 牛肉膏蛋白胨培养基（1000ml, 配制时，只加800ml，每个三角瓶分装180ml），15%脱脂奶粉溶液（脱脂奶粉用水溶解后应单独灭菌（0.06MPa,30min）， 铺平板前与加热溶化的肉汤蛋白胨培养基混合），盛9ml无菌水的试管，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，无菌玻璃涂棒、1ml吸管（4支），10ml吸管（1支）和培养皿（10套），接种环等。
3. 水浴锅 四、操作步骤
1. 牛奶平板制备（4人/组）
牛肉膏蛋白胨培养基（180ml）融化，待冷至55－60℃时，添加20ml无菌15%脱脂奶粉溶液混合均匀，配制终浓度为1.5%的牛奶牛肉膏蛋白胨培养基；到平板。
2. 土壤样品的处理
将采集的土壤样品做成菌悬液（10-2）后置于80℃水浴中加热10～20分钟以杀死不能形成芽孢的菌体。
3. 稀释涂布分离法
（1）制备样品稀释液 称取10克土壤，放入盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20分钟。用一支1ml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液，注入盛有9ml无菌水的试管中，吹吸3次，使其充分混匀。加热杀死不能形成芽孢的菌体。然后再用一支1ml无菌吸管从此试管中吸取1ml注入另一盛有9ml无菌水的试管中，以此类推制成10-2、10-3、10-4各种稀释度的土壤悬液溶液。
（3）涂布 将平板底面分别写好10-2、10-3、10-4三种稀释度，然后用无菌吸管分别从10-4、10-3、10-2三管土壤稀释液中各吸取0.2ml对号放入平板中，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。
（4）培养 将平皿倒置37℃培养30小时左右。
五、实验报告
1. 初步获得的H/C比值大，产蛋白酶活力高的芽孢杆菌菌株。
实验十二 产蛋白酶芽孢杆菌的分离筛选（二） ————产蛋白酶芽孢杆菌的筛选与初步鉴定
一、目的和要求
1. 了解并掌握产蛋白酶菌株的筛选模型。 2. 掌握芽孢有无的鉴定方法。
3. 进一步掌握划线分离得到纯种菌株的方法。 二、实验原理
许多芽孢杆菌能分泌分泌蛋白酶，淀粉酶，可以选择酪蛋白或淀粉为主要营养成分的分离培养基，因菌体分泌的酶可以将大分子的蛋白或淀粉水解而在菌落周围形成透明圈。根据透明圈直径(H)和菌落直径(C)之比值(H/C)可以初步确定酶活力，其比值越大，酶活力越高，进而可筛选出高产酶活的菌株。
细菌简单染色、芽孢染色、划线分离原理见先前实验。 三、实验器材
1. 牛奶平板。
2. 显微镜、简单染色和芽孢染色试剂等。 3. 培养箱。 四、操作步骤：
1、产蛋白酶菌株的观察
对牛奶平板上的总菌数和产蛋白酶的菌数进行记录，选择蛋白酶水解圈最大的4个菌株进行编号，用米尺分别测量、记录菌落和透明圈的直径。观察菌落特征。
2、划线分离纯化菌株（上次实验任务）
将上述初步分离的芽孢杆菌在牛奶平板上划线分离培养，分离纯化，得到单菌落。
3、牛奶平板制备透明圈大小测定
进一步观察牛奶平板透明圈，测定透明圈直径(H)和菌落直径(C)之比值(H/C)。 4、 简单染色
选最大透明圈的菌株进行简单染色。观察细胞形态。 5、芽孢染色
选最大透明圈的菌株进行芽孢染色。观察芽孢形成情况。 6、菌种保藏
将实验分离得到的高产蛋白酶芽孢杆菌接种保藏在牛肉膏蛋白胨试管中，作为后续实验的菌种使用。 五、实验报告
1. 绘制菌体形态图，给筛选到的高产蛋白酶芽孢杆菌做一个初步鉴定报告。
实验十三 酵母菌的筛选及其糖发酵试验研究（一）
——酵母菌的富集培养与分离
一、目的和要求
学会从自然界各种基质中富集和分离酵母菌的方法。 二、实验原理
自然界中的土壤、水果、酒曲等基质中含有大量的微生物，其中有霉菌、酵母和细菌，酵母菌的数量一般不占优势，直接分离酵母菌往往不易成功。在液体中，酵母菌生长比霉菌快；而酸性培养基中酵母菌比细菌生长更适宜。因此，可以利用这二个特性，用酸性液体培养基对所分离的样品进行加富培养，使酵母菌数量占优势然后用稀释平板分离法或划线分离法分离酵母菌，获得酵母菌的纯培养物。 三、实验器材
1.分离材料：采集种植蔬菜的土壤、果园土壤，或酒曲、葡萄等水果。样品由各小组自备。
2.培养基：豆芽汁培养基（附录三、3）。 3.器材：无菌平板、无菌吸管、无菌水等。 四、操作步骤
1.配制培养基：（4人/组）
（1）酵母菌富集培养基：酸性蔗糖豆芽汁（加乳酸0.5%）培养液分装大试管，灭菌。(4支/组)
（2) 蔗糖豆芽汁琼脂，分装三角瓶，灭菌（10皿/4人）。 2.分离：
（1）富集培养：取少许待分离的样品投入酸性豆芽汁培养液中，摇动后将该试管置25-28℃培养箱中培养，2天后取1mL菌悬液转接到另一管酸性培养液中培养2天，取样制水浸片镜检观察到有酵母菌时，进行酵母菌分离。
（2）酵母菌分离：采用稀释平板分离法。根据样品中酵母菌的数量决定样品的稀释度，
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一般取10、10、10稀释度涂布蔗糖豆芽汁琼脂平板。28℃培养2-3天。获得单菌落。
（3）酵母菌鉴定及菌种培养与保存：尽量选取菌落形态有差异的菌落，取少许单菌落的菌体制片镜检个体形态为酵母菌，将该单菌落的其余菌体转接划线至蔗糖豆芽汁琼脂平板，28℃培养2天保存备用，并对菌株进行编号。 五、实验报告：
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