限制性内切酶基础知识
?限制性内切酶 ? ? ? ? 限制性内切酶基础知识 限制性内切酶关键注意事项 限制性内切酶疑难解决指南 限制性内切酶在基因组作图与分析中的应用
如果没有限制性内切酶，当今的分子生物学研究会是个什么样子？40年来，限制性内切酶这个幕后成员默默推动着许多基础生物学研究和商业化应用 。限制性内切酶（又称限制酶）首先是在细菌体内发现的，但后来在部分古细菌中也发现了这种成分。通常，限制性内切酶会切割双链 DNA。每个限制性内切酶会识别特定的 DNA 序列，根据不同的内切酶类型，可在识别序列内或距识别序列不远的位置处切割 DNA。识别序列长度通常为 4 - 8 bp，酶切之后会形成粘性末端（5′ 或 3′ 突出端）和平末端（图 1）。
图 1.特定限制性内切酶切割后形成的粘性或平末端（5′ 或 3′ 端）示意图。
如今业内已经鉴定了大约 4000 种限制性内切酶，其中超过 600种 可商业化供应。REBASE是一个非常有用的资源库，可查询限制性内切酶全面信息及更新信息，包括限制性内切酶的特异性、灵敏度和商业化来源等 [1]。 本页内容： ? ?
限制性内切酶发展史 许多克隆含有空载体
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限制性内切酶分类 识别位点和酶切特异性
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限制性内切酶发展史
上世纪 50 年代初期，许多研究团队观测到了噬菌体对于同一物种的不同细菌宿主菌株存在感染效率差异 [2,3]。Grasso 和 Paigen 对此的描述如下：使用在一种细菌菌株（例如，大肠杆菌 C）内繁殖的噬菌体 λ 感染同一种类的另一菌株（例如，大肠杆菌K），结果发现，相比于重新感染宿主菌株（大肠杆菌C），大肠杆菌 K 的感染率出现明显下降。新的宿主（大肠杆菌K）似乎可以选择性抵御或“耐受”侵入的噬菌体。研究人员还发现，这一现象并没有遗传
性，因为经过一轮感染后，在新菌株中生长的噬菌体还可以以正常的感染率感染该菌株。这种现象被称为“宿主控制变异”，有关其背后的机制也成为了频繁研究的领域 [4]。
直到上世纪 60 年代，人们才发现宿主控制变异的机制，其与噬菌体 DNA 的酶切有关，进而发现并分离出了限制性内切酶。上世纪 60 年代初 Werner Arber 观测发现，宿主范围的决定性遗传物质都存在于噬菌体 DNA之中，而后续实验证明甲硫氨酸参与宿主的自我保护[5]。这些发现最终催生了限制性修饰 (R-M) 体系的概念，通过该体系，来自于宿主的限制性内切酶和甲基化酶共同作用，切割外来病毒（非甲基化） DNA，同时保护宿主的 DNA 不受甲基化 [6]。
颇为有趣的是，大多数 R-M 体系的早期研究工作围绕限制性内切酶的 Type I 和 Type III 基团进行，该分类方法主要依据限制性内切酶的结构和功能（参见限制性内切酶分类）。然而在 Kent Wilcox 和 Hamilton Smith 发现第一种 Type II 级限制性内切酶 HindII 之前，限制性内切酶显然还未得到充分利用[7]。HindII 能够识别特定的对称 DNA 序列，按照精确的方式切割识别序列内的位点。此功能（大多数早期 Type II 限制性内切酶均发现存在此功能）促使 Kathleen Danna 和 Daniel Nathans 使用 HindII 研究猿猴空泡病毒 40 DNA 物理图谱[8]，即所谓的限制性内切酶图谱。
凭借在限制性内切酶方面的开创性研究，Daniel Nathans、Hamilton Smith 和 Werner Arber 共同获得 1978 诺贝尔生理学或医学奖。随着 DNA 连接酶的发现以及位点特异性限制性内切酶家族不断壮大，重组 DNA 技术应运而生。
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限制性内切酶命名规则
该命名规则综合考虑到内切酶来源的三种特性——属名、种名和菌株或血清型——组成了一个简短的名称，后面加上罗马数字，代表来自同一菌株的多个限制性内切酶 [9]。例如，HindIII 酶（或者按照早期命名规则命名为 Hind III）代表：
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“H”代表Haemophilus “in”代表influenzae “d”代表血清型d “III”用于区分来自于Haemophilusinfluenza血清型d的其它限制性内切酶（例如， HindII 和 HindIII）。
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限制性内切酶分类
根据结构的复杂程度、识别序列、切割位点位置以及辅助因子要求，限制性内切酶分为四类。表 1汇总了各类内切酶的区分特点 表 1.限制性内切酶类别和特性。
内切酶类别 特点 Type I ? ? ? 同时具有限制性和甲基化活性的多亚基蛋白 需要ATP 切割位点与识别位点间的间距不定 Type II ? ? ? ? 特异性的识别序列 切割位点位于识别序列内或邻近识别序列 在切割位点生成 5′ 磷酸基和 3′ 羟基末端 需要 Mg2+ Type III ? ? ? 由两个相反方向的识别序列组成 切割位点与其中一个识别序列的间距恒定 需要ATP Type IV ? ? 仅切割甲基化的 DNA 切割位点大约距离识别位点 30 bp 由于自身特殊的特点， Type II 限制性内切酶已经成为分子克隆、法医学 DNA 分析等许多研究应用最常用的限制性内切酶。这类内切酶的特殊切割方式使其得以应用在限制性片段长度多态性 (RFLP)分析，而后者也是法医学研究的基础。连接酶可酶促连接 DNA 末端的 5′ 磷酸基和 3′ 羟基，从而使得DNA可以通过限制性内切酶产生的5′ 磷酸基和 3′ 羟基末端进行重排和连接—这也是重组 DNA 技术的基本原理。
由于在分子生物学研究方面很有用处，Type II 限制性内切酶成为了研究最多的酶类别，其成为了最大的内切酶类别。目前经过鉴定的 Type II 限制性内切酶超过 3,500 种，这些酶又被
进一步细分成 Type IIP、IIA、IIB、IIC、IIS 等子类别——其中的 Type IIP 酶可识别回文（对称）靶标序列，是最流行的商业化限制性内切酶 [10]。
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识别位点和切割特异性
另一个将限制性内切酶进行分类和比较的重要方法是同裂酶和异裂酶。 ?
同裂酶是具有相同识别序列及相同特异性的限制性内切酶。例如，AgeI 和 BshT1 可通过相同的图谱识别和切割 5′-A↓CCGGT-3′。但一系列同裂酶可能在首选位点、反应条件、甲基化敏感度和星号活性方面存在差异。 ?
异裂酶可以识别相同的核苷酸序列，但会在不同的位点切割 DNA。例如，异裂酶 SmaI (5′-CCC↓GGG-3′) 和 XmaI (5′-C↓CCGGG-3′)均可识别 5′-CCCGGG-3′ 但切割方式不同，因而产生不同类型的末端（此时，SmaI 产生平端，而 XmaI 产生 5′ 突出末端）。 识别序列和切割图谱方面的不同使限制性内切酶成为极其灵活、强大的基因材料鉴定和操作工具。
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参考文献
1. Roberts RJ, Vincze T, Posfai J, Macelis D (2015) REBASE—a database for DNA restriction and modification: enzymes, genes and genomes.Nucleic Acids Res43:D298–D299.
2. Luria SE, Human ML (1952) A nonhereditary, host-induced variation of bacterial viruses.J Bacteriol64:557–569.
3. Bertani G, Weigl, JJ (1953) Host controlled variation in bacterial viruses.J Bacteriol65:112–121.
4. Grasso RJ, Paigen K (1968) Loss of host-controlled restriction of λ bacteriophage in Escherichia coli following methionine deprivation.J Virol2:1368–1373.
5. Arber W (1965) Host specificity of DNA produced by Escherichia coli V. The role of methionine in the production of host specificity.J Mol Biol11:247–256. 6. Arber W (1965) Host-controlled modification of bacteriophage.Annu Rev Microbiol19:365–378.
7. Kelly TJ, Smith HO (1970) A restriction enzyme from Hemophilus influenzae II.J Mol Biol51:393–409.
8. Danna K, Nathans D (1971) Specific cleavage of simian virus 40 DNA by restriction endonuclease from Hemophilus influenza.Proc Natl Acad Sci USA68:2913–2917. 9. Smith, HO, Nathans D (1973) Letter: a suggested nomenclature for bacterial host modification and restriction systems and their enzymes.J Mol Biol81:419–423.
10. Pingoud A, Wilson GG, Wende W (2014) Type II Restriction Endonucleases – a Historical Perspective and More.Nucleic Acids Res42:7489–7527.
限制性内切酶关键注意事项
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限制性内切酶一般反应条件
当进行限制性酶切反应时，为确保最佳的反应条件，务必要遵守限制性内切酶供应商提供的建议。在此过程中需要考虑的重要参数包括：底物 (DNA) 和酶的量、反应体积以及孵育时间。 根据传统的定义，在最佳反应条件下，一个单位的限制性内切酶可以在1小时内，在 50 μL体系中 完全酶切 1 μL 定义底物（例如，质粒 pUC19）。尽管单位定义提供了一种测定方式，但还需注意，根据 DNA 底物之中的识别序列出现的频率及所用底物类型，针对不同DNA底物使用等量的限制性内切酶可能需要不同的最佳反应条件。实际上，酶供应商往往根据 DNA 样本的潜在质量、数量和性质波动，推荐比完全酶切所需量多 5 至 20 倍的酶（或 1 μL 酶/反应体积）。
为确保限制性内切酶的有效活性，应按照制造商的建议妥善存储并在过期前使用。通常情况下，应将酶分成小等份，存储在 –20?C 条件下的无霜冰箱之中，从而在维持活性的同时最大限度避免反复冻融。DNA 样本应避免接触可能抑制酶并造成其它负面效应的污染物，如核酸酶、盐、有机溶剂（例如，苯酚、氯仿或乙醇）以及洗涤剂。
为避免在 –20°C 条件下结冰，限制性内切酶往往采用 50% 的甘油溶液形式提供。但甘油自身的粘度可能导致反应配制阶段移液和少量酶加样较为困难。最好是最后添加酶至终体积，添加之后就充分混匀。“用手指轻弹反应管”轻柔混匀，然后短暂离心反应管，可帮助酶在反应混合物中充分扩散，并在反应管底部收集到反应溶液。
在孵育过程中，反应须达到所需的温度，并在整个孵育期间保持恒定。如果使用 5-15分钟完全酶切的快速限制性内切酶代替1小时酶切的传统限制性内切酶时，这一点尤为重要。须格外谨慎地密封反应管以避免样本蒸发，否则可能造成孵育时间延长（例如，延长至>1 小时）和体积减少（例如，减少至 <10 μL）。
除了一般的注意事项外，在您进行实验时还需注意限制性酶切的以下方面：
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星号活性
? 预料之外的切割图谱 ? 质量/使用寿命
分子生物学实验技巧
