结核病免疫学辅助诊断检查
利用免疫学原理检查机体对分枝杆菌、特别是结核分枝杆菌感染造成的免疫反应,从而帮助临床医师进行鉴别诊断;但由于结核分枝杆菌的生物特性及此类病原菌引起的人体免疫反应较为特殊和复杂,截止到目前为止,结核病的免疫学检查在临床诊断中的作用尚存有较大争议。
因此,目前结核病免疫学的检测结果,在结核病的临床诊治中,只能够作为辅助参考,不能作为结核病诊断和评价治疗效果的指标。临床医师在参考免疫学检查结果的同时,必须同时参照结核分枝杆菌的传统微生物学检查(包括抗酸染色镜检、特别是分枝杆菌培养检查) 的结果并参考其它临床检查手段所得到的结果进行综合判断。
(一)结核病免疫学检查试剂盒概述
根据我国临床生物诊断试剂的规定,用于结核病免疫学检查的试剂盒,必须具有国家药品监督管理局颁发的生产文号。
目前,我国已颁发生产文号的结核病免疫学检测试剂盒,按照相应的实验步骤,可分为两大类:一类试剂盒检测的标本一般为血清,是利用ELISA实验原理进行检测,此类试剂盒中都应具有相应的阴性、阳性和空白对照试剂;另一类试剂盒采用快速金标法进行检测实验,检测的标本有血清和全血,此类试剂盒均应具备显示反应正常的质控线或斑点。
由于结核病免疫学检查的试剂盒种类及相应实验步骤区别较大,故请开展此项检查工作的实验室严格按照选用试剂盒厂家提供的说明书进行实验、判断和报告结果。
(二)结核病免疫学检查试剂盒实验的质量控制
1、 完成结核病免疫学检查实验的操作人员必须经过专门培训。
2、 必须选用具备国家药品监督管理局颁发生产文号的检测试剂盒;同时生产厂商提供操作的技术培训和指导。
3、 使用的试剂盒必须在有效期内;检测实验记录中必须包括试剂盒的生产批号。 4、 进行检测的相应标本必须符合试剂盒说明书中列举的种类和质量标准。
5、 采用ELISA技术完成检测的试剂盒,每次实验必须设立阴性、阳性和空白对照;严格按照试剂盒说明书提供的操作步骤完成检测实验,如果相应对照样本检测结果出现问题,必须进行重新实验并分析记录引起问题的可能原因。
6、 采用快速金标方法完成检测实验的试剂盒,每批试剂盒投入正常使用前,相应实验室应使用检测结果已知为阳性、阴性的标本或使用生产厂家提供的对照预先进行检测,检测结果相符后方可投入正常使用。
7、 对于结果检测值处于无效区和灰区的样本必须进行全过程的重复检测并根据重复检测值报告结果。
本文归纳了结核病细菌学检验所包括的4项基本技术(涂片染色镜检、分枝杆菌分离培养、分枝杆菌药物敏感性试验、分枝杆菌菌种鉴定)以及结核杆菌临床基因扩增(PCR)检验技术、分枝杆菌快速培养及药物敏感性试验技术、免疫学有关检测技术的国家规范。结核病实验室检查,特别是细菌学检查是结核病确诊和治疗的主要依据。虽然这些常规检查方法在技术上比较成熟,但笔者认为尚存在以下几个问题:
1、 结核病诊断方法,目前只是在结核病防治系统内初步得到规范和质量控制,但结核病最初的诊断约85%是在综合性医院里,而恰恰是在综合性医院里结核病的细菌学诊断尚不够规范且水平参差不齐,所以加强和提高综合性医院的结核病细菌学诊断水平是我们今后工作的重点之
一。
2、 结核病的诊断技术目前还处在较低的水平,国际推荐的涂片和培养方法也还分别存在着特异性差、敏感性低和结果报出时间太长的不足,因此不断加强结核病诊断新技术的研究和开发仍然是十分必须的。结核菌的快速培养系统是一项得到国际认可的结核菌检测技术,大大提高了培养结果的报出时间,但由于仪器设备昂贵,检测成本太高而较难推广普及。敏感、特异、快速、经济、个体化是今后结核病实验室诊断的发展方向。
鉴于结核病实验室检查、特别是细菌学检查在结核病控制工作中的重要性,为保障相应检查项目结果的可靠性,要求相应的检查项目必须由经过培训并考核合格的专职人员完成,且开展相应检查的实验室应具备安全操作设施并制定实验室内部质量控制措施,同时接受专业结核病参比实验室的质量控制督导和培训。
结核病的免疫学诊断
十几年来国内外学者一直从MT培养滤液中提纯蛋白质抗原,由于该方法制备蛋白抗原较烦琐、费时。因此,近年来,笔者研究室应用基因工程技术克隆、表达MT基因,简便地获得了大量MT单一的蛋白抗原(如CFPl0、ESAT6、MPT63、MPT64、Ag85A、Ag85B、KatG、16ku、3Sku、65ku等蛋白),研究其诊断应用价值。
(1)血清学诊断 20世纪70年代应用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测患者血清中结核特异性抗体,成为结核病常用的辅助诊断手段之一,尤其是近十几年来金标免疫斑点法检测抗原抗体反应已成为无需特殊仪器的快速诊断技术。由于结核患者免疫功能不同而导致对MT抗原识别的差异,此外结核患者对抗原的识别存在阶段特异性,目前任何一个单一的抗原或商品化的组合抗原检测试剂盒都无法检测出所有结核患者血清中的抗结核抗体,结核病患者的抗体反应是针对许多MT抗原的。因此,筛选多个纯化的结核病的特异性抗原组成联合抗原是目前血清学诊断的研究方向。
特异性、敏感性、阳性预测值、阴性预测值。TB-DOT\\TB-CHECK\\TB-PPD。 MPT64结核杆菌分泌到体外的蛋白质。
(2)皮肤试验 结核菌素、纯蛋白衍生物(PPD)皮肤试验是最常用且最简便的一种结核分枝杆菌感染诊断方法,但由于PPD中含有许多分枝杆菌共同的抗原,PPD皮试阳性并不能鉴别是因为MT复合群感染还是接触环境中NTM或卡介苗接种后造成的致敏。因此,PPD皮试诊断的特异度差,用该方法进行结核病流行病学调查获得的结核分枝杆菌感染率并不能真正反映人群中结核分枝杆菌感染的实际状况。目前国内外学者通过动物模型或临床试验研究纯化抗原、合成多肽和重组蛋白,筛选致病性结核分枝杆菌表达而BCG不特异抗原,以期建立新的结核皮肤诊断试剂。
假阳性,假阴性,无反应。
PPD阴性,经1--3周再试验,如PPD阳性,结核。PPD阴性,不考虑结核。
(3)双抗体夹心ELISA检测细胞因子水平 目前的研究已表明活动性肺结核、结核性胸膜炎或脑膜炎患者血液中或局部组织的T淋巴细胞、单核细胞或巨噬细胞在MT抗原的激活下,释放可溶性白细胞介素(1L-2)受体、膜IL-2受体、γ干扰素(1FN-γ)、。肿瘤坏死因子、IL-18和IL-8的
水平不同,与正常人或非结核性疾病差异有显著性。因此,采用双抗体夹心ELISA检测其在血清、胸腔积液、脑积液中的水平,对结核病具有辅助诊断和鉴别诊断价值;对抗结核疗效和病情转归的评价具有一定的临床意义。
(4)T淋巴细胞增殖试验 MT特异的蛋白抗原(如ESAT6、CFPl0蛋白等)可刺激结核分枝杆菌感染的人和牛外周血单个核细胞(PBMC)产生增殖反应和大量的IFN-γ,而卡介苗接种的健康人对该抗原反应水平低,其特异性显著高于MT超声抗原和培养滤液。结核病在疾病发展的不同阶段,T淋巴细胞识别的结核抗原也不尽相同,因此,目前正通过双抗体夹心ELISA检测PBMC受特异抗原刺激后产生IFN-了的水平,或通过酶联免疫斑点试验(ELISPOT)检测分泌IFN-丁的外周血T淋巴细胞,建立新的灵敏度高、特异度强的诊断结核分枝杆菌感染的特异性方法。但这些方法均为体外的T细胞试验,技术较复杂,需要高度纯化的MT特异的蛋白或多肽抗原及用于细胞培养和细胞因子检测的仪器、设备,可能难以在临床上常规应用。
(5)T细胞亚群分析 结核病患者存在明显的细胞免疫功能紊乱,其外周血CD+3、CD+4T淋巴细胞下降,CD+8T淋巴细胞增高,CD+4/CD+8值降低,同时伴有T细胞活化功能障碍,尤其是活动性结核病更为显著;但结核性胸腔积液中淋巴细胞比例、CD+4T淋巴细胞显著升高。分析T细胞亚群的变化对于病情监控、疗效判定和预后判断都具有重要意义,并有助于结核性和癌性胸腔积液的鉴别。
(6)红细胞免疫功能测定 红细胞免疫系统新概念是1981年由美国学者Siegel提出的,经过20多年国内外学者的研究发现,红细胞CRl有黏附C3b、C4b的能力。测定结核病患者红细胞免疫黏附能力和红细胞免疫黏附促进因子,结果两者均明显低于正常人,结核病患者红细胞免疫促进因子下降可能是其红细胞免疫黏附功能降低的重要原因之一。因此,红细胞免疫功能测定可作为结核患者免疫功能状态的一个新指标,为结核患者的免疫治疗、判断愈后提供依据。
结核治疗效果不佳,初始耐药,非结核分枝杆菌。牛性也可能是非结核分枝杆菌。
过近6年的研究,采用分子生物学技术,找到了可以明显提高菌阴肺结核检出率的最佳方案——五种方法联合同步检测法。
目前全世界结核菌感染人数占世界总人口数的1/3,全球结核病 人约2000万,中国肺结核病人约600万。在肺结核病人中,大约有50 %~70%的病人痰中检查不出结核菌,即所谓菌阴肺结核(经3次痰涂片和一次培养均为阴性者)。由于菌阴肺结核的诊断缺乏“金标准”,诊断困难,极易发生漏诊、误诊、漏治、误治、过治,不仅给病人增加了负担,还给社会带来负担和危害。因此,如何准确对菌阴者进行诊断和治疗,是亟待解决的一个难题。河南省结核病防治所原所长、主任医师王国斌和主任医师叶德普等,为寻找出一组较灵敏、快捷、简便、特异的诊断菌阴肺结核的方案,进行了长期的探索。他们在传统诊断肺结核的临床方法(症状、病史、血象、胸片、结核菌素试验、痰涂片或培养)的基础上,采用聚合酶链反应、酶联免疫吸附试验、结核特异性循环免疫复合物、结核抗体包括结核分枝杆菌壁糖脂免疫球蛋白、卡介苗免疫球蛋白等五种方法进行同步检测,对菌阳肺结核、菌阴肺结核、非结核性肺部疾病、健康人群分别作了对比观察研究。结果证明,上述五种方法联合检测可将菌阴结核的检出率提高到85.7%;而用一种或两种方法的检出率只有21.4%~44%。有关专家认为,这种方法简便、易行、快速,在我国县以上医院 可以常规开展,能明显提高对菌阴肺结核的诊治,减少误诊、误治,有效控制结核病。此成果已被评为河南省医药卫生科技成果一等奖。
由于诊断不明,结核病人被误治、漏治特别是当作癌症过治的情况在临床并不鲜见。准确及时诊断与病人治疗关系重大。本期我们介绍两则有关结核病临床诊断研究进展的消息,希望对医生、患者有所帮助
结核病免疫学辅助诊断检查
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